Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

Summary

Aquí, presentamos un método TGA modificado para la estimación del contenido de lignina en biomasa vegetal herbácea. Este método estima el contenido de lignina formando enlaces específicos de tioéter con lignina y presenta una ventaja sobre el método de Klason, ya que requiere una muestra relativamente pequeña para la estimación del contenido de lignina.

Abstract

La lignina es un polímero natural que es el segundo polímero más abundante en la Tierra después de la celulosa. La lignina se deposita principalmente en las paredes celulares secundarias de las plantas y es un heteropolímero aromático compuesto principalmente por tres monolignoles con una importancia industrial significativa. La lignina juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas, protege de las tensiones bióticas y abióticas, y en la calidad del forraje, la madera y los productos industriales de lignina. La estimación precisa del contenido de lignina es esencial tanto para la comprensión fundamental de la biosíntesis de lignina como para las aplicaciones industriales de la biomasa. El método del ácido tioglicólico (TGA) es un método altamente confiable de estimar el contenido total de lignina en la biomasa vegetal. Este método estima el contenido de lignina formando tioéteres con los grupos de alcohol bencílico de lignina, que son solubles en condiciones alcalinas e insolubles en condiciones ácidas. El contenido total de lignina se estima utilizando una curva estándar generada a partir de lignina de bambú comercial.

Introduction

La lignina es uno de los componentes de carga vitales de las paredes celulares de las plantas y el segundo polímero más abundante en la Tierra^1. Químicamente, la lignina es un heteropolímero reticulado compuesto por compuestos fenólicos complejos de alto peso molecular que forman una fuente natural renovable de polímeros aromáticos y síntesis de biomateriales^2,3. Este polímero natural juega un papel importante en el crecimiento de las plantas, el desarrollo, la supervivencia, el soporte mecánico, la rigidez de la pared celular, el transporte de agua, el transporte de minerales, la resistencia al alojamiento, el desarrollo de tejidos y órganos, la deposición de energía y la protección contra tensiones bióticas y abióticas^4,5,6,7. La lignina se compone principalmente de tres monolignoles diferentes: alcoholes de coniferilo, sinapilo y p-coumaril que se derivan de la vía proanoide fenilo^8,9. La cantidad de lignina y la composición de los monómeros varían según la especie vegetal, el tipo de tejido/órgano y las diferentes etapas del desarrollo de las plantas¹⁰. La lignina se clasifica ampliamente en lignina de madera blanda, madera dura y hierba en función de la fuente y la composición del monolignol. La madera blanda se compone principalmente de alcohol de coniferilo en un 95% con un 4% de p-coumaryl y un 1% de alcoholes sinapílicos. La madera dura tiene alcoholes de coniferilo y sinapilo en proporciones iguales, mientras que la lignina de hierba está compuesta por varias proporciones de alcoholes de coniferilo, sinapilo y p-coumarílico^11,12. La composición de los monómeros es crítica, ya que determina la resistencia a la lignina, la descomposición y la degradación de la pared celular, así como la determinación de la estructura molecular, la ramificación y la reticulación con otros polisacáridos^13,14.

La investigación de la lignina está ganando importancia en forrajeo, industrias textiles, industrias papeleras, y para bioetanol, biocombustibles y bioproductos debido a su bajo costo y alta abundancia^15,16. Se utilizaron varios métodos químicos (por ejemplo, bromuro de acetilo, detergentes ácidos, Klason y oxidación de permanganato) junto con métodos instrumentales (por ejemplo, espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrofotometría ultravioleta (UV)) para la cuantificación de lignina^9,17. Los métodos de análisis de lignina generalmente se clasifican en función de la radiación electromagnética, la gravimetría y la solubilidad. El principio detrás de la estimación de la lignina por radiación electromagnética se basó en la propiedad química de la lignina por la cual absorbe la luz en longitudes de onda específicas. Estos resultados fueron estimados basados en el principio que la lignina tiene una absorbancia ULTRAVIOLETA más fuerte que carbohidratos. En 1962, Bolker y Somerville utilizaron pellets de cloruro de potasio para estimar el contenido de lignina en la madera¹⁸. Sin embargo, este método tiene inconvenientes en la estimación del contenido de lignina a partir de muestras herbáceas debido a la presencia de compuestos fenólicos no lignina y la ausencia de un coeficiente de extinción adecuado. En 1970, Fergus y Goring encontraron que los máximos de absorción de los compuestos de guaiacyl y syringyl estaban en 280 nm y 270 nm, lo que corrigió el problema del coeficiente de extinción del método Bolker y Somerville¹⁹. Más tarde, la espectroscopia infrarroja, una técnica altamente sensible para caracterizar fenólicos, también se utilizó para la estimación de lignina con una pequeña cantidad de muestras de biomasa vegetal. Un ejemplo de esta tecnología fue la espectrofotometría de transformada de Fourier de reflectancia difusa. Este método, sin embargo, carece de un estándar adecuado similar al método UV²⁰. Más tarde, el contenido de lignina fue estimado por NIRS (espectroscopia de infrarrojo cercano) y RMN (espectroscopia de resonancia magnética nuclear). Aunque, hay desventajas en estos métodos, no alteran la estructura química de la lignina, conservando su pureza^20.

El método gravimétrico de Klason es un método analítico directo y más fiable para la estimación de lignina de tallos leñosos. La base para la estimación gravimétrica de la lignina es la hidrólisis/solubilización de compuestos no lignínicos y la recolección de lignina insoluble para gravimetría^21. En este método, los hidratos de carbono se eliminan por hidrólisis de la biomasa con H2 CONCENTRADO₂SO₄ para extraer residuos de lignina^20,22. El contenido de lignina estimado por este método se conoce como lignina insoluble en ácido o lignina Klason. La aplicación del método Klason depende de la especie de planta, el tipo de tejido y el tipo de pared celular. La presencia de cantidades variables de componentes no lignínicos como taninos, polisacáridos y proteínas, da lugar a diferencias proporcionales en la estimación del contenido de lignina insoluble/soluble en ácido. Por lo tanto, el método de Klason sólo se recomienda para la estimación de lignina de biomasa con alto contenido de lignina, como los tallos leñosos^17,23. Los métodos de solubilidad como el bromuro de acetilo (AcBr), la lignina insoluble en ácido y el ácido tioglicólico (TGA) son los métodos más comúnmente utilizados para estimar el contenido de lignina de varias fuentes de biomasa vegetal. Kim et al. establecieron dos métodos para la extracción de lignina por solubilización. El primer método extrae lignina como residuo insoluble solubilizando celulosa y hemicelulosa, mientras que el segundo método separa la lignina en la fracción soluble, dejando la celulosa y la hemicelulosa como residuo insoluble^24.

Métodos similares empleados en la estimación de la lignina basados en la solubilidad son los métodos del ácido tioglicólico (TGA) y del bromuro de acetilo (AcBr)²⁵. Tanto los métodos de TGA como los de bromuro de acetilo estiman el contenido de lignina midiendo la absorbancia de la lignina solubilizada a 280 nm; sin embargo, el método AcBr degrada los xilanos durante el proceso de solubilización de lignina y muestra un falso aumento en el contenido de lignina²⁶. El método del tioglicolato (TGA) es el método más confiable, ya que depende de la unión específica con los grupos de tioéter de los grupos de alcohol bencílico de lignina con TGA. La lignina unida a TGA se precipita en condiciones ácidas utilizando HCl, y el contenido de lignina se estima utilizando su absorbancia a 280 nm^27. El método TGA tiene ventajas adicionales de menos modificaciones estructurales, una forma soluble de estimación de lignina, menos interferencia de componentes no lignina y una estimación precisa de lignina debido a la unión específica con TGA.

Este método de TGA se modifica en función del tipo de muestra de biomasa vegetal utilizada para la estimación del contenido de lignina. Aquí, modificamos y adaptamos el método rápido de TGA de pajitas de arroz²⁷ a los tejidos de algodón para estimar el contenido de lignina. Brevemente, las muestras de plantas en polvo secas se sometieron a tampón de solubilización de proteínas y extracción de metanol para eliminar las proteínas y la fracción soluble en alcohol. El residuo insoluble del alcohol fue tratado con TGA y la lignina precipitada bajo condiciones ácidas. Se generó una curva estándar de lignina utilizando lignina de bambú comercial y se obtuvo una línea de regresión (y = mx+c). El valor “x” utiliza valores de absorbancia promedio de lignina a 280 nm, mientras que los valores “m” y “c” se ingresaron desde la línea de regresión para calcular la concentración desconocida de lignina en muestras de biomasa de plantas de algodón. Este método se divide en cinco fases: 1) preparación de muestras de plantas; 2) lavar las muestras con agua y metanol; 3) tratamiento del pellet con TGA y ácido para precipitar lignina; 4) precipitación de lignina; y 5) la preparación de la curva estándar y la estimación del contenido de lignina de la muestra. Las dos primeras fases se centran principalmente en la preparación del material vegetal, seguida de las extracciones de agua, PSB (tampón de solubilización de proteínas) y metanol para obtener el material insoluble en alcohol. Luego, se trató con TGA (ácido tioglicólico) y HCl para formar un complejo con lignina en la tercera fase. Al final, se utilizó HCl para precipitar lignina, que se disolvió en hidróxido de sodio para medir su absorbancia a 280 nm^28.

Protocol

1. Preparación de muestras de plantas Recoger plantas de algodón de dos meses de edad del invernadero (Figura 1A). Voltee las macetas de las plantas suavemente para separar el suelo y las raíces con raíces laterales intactas aflojando el suelo alrededor de la planta (Figura 1B). Lavar bien las plantas recolectadas en bandejas llenas de agua para eliminar toda la suciedad (para muestras de raíces) (Figura 1C…

Representative Results

Se compararon dos líneas experimentales de algodón diferentes para las diferencias en su contenido de lignina en diferentes tejidos. El contenido de lignina extraído de cada muestra se midió a 280 nm y registró sus respectivos valores de absorbancia. Los valores medios de absorbancia de cada réplica biológica se compararon con la línea de regresión de la curva estándar de lignina(Tabla 2, Figura 3C). La línea de regresión, y = mx + c, se utiliza para calcular el …

Discussion

La lignina desempeña un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas y recientemente ha sido ampliamente estudiada para aplicaciones de biocombustibles, bioenergía y bioproductos. La lignina es rica en compuestos aromáticos que se almacenan en todas las paredes celulares secundarias de las plantas vasculares. Tiene varias aplicaciones industriales como productos de paneles de madera, biodisponantes, floculantes, espumas de poliuretano y en resinas de placas de circuitos^29,<sup…

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples