Uppskattning av växtbiomassa Ligninhalt med tioglykolsyra (TGA)

Summary

Här presenterar vi en modifierad TGA-metod för uppskattning av ligninhalten i örtartad växtbiomassa. Denna metod uppskattar ligninhalten genom att bilda specifika tiodelsbindningar med lignin och utgör en fördel jämfört med Klasonmetoden, eftersom det kräver ett relativt litet urval för uppskattning av lignininnehåll.

Abstract

Lignin är en naturlig polymer som är den näst mest rikliga polymeren på jorden efter cellulosa. Lignin deponeras huvudsakligen i växtens sekundära cellväggar och är en aromatisk heteropolymer som främst består av tre monolignolen med betydande industriell betydelse. Lignin spelar en viktig roll i växttillväxt och utveckling, skyddar mot biotiska och abiotiska påfrestningar och i kvaliteten på djurfoder, trä och industriella ligninprodukter. En korrekt uppskattning av ligninhalten är avgörande för både grundläggande förståelse av ligninbiosyntesen och industriella tillämpningar av biomassa. TGA-metoden (Thioglycolic Acid) är en mycket tillförlitlig metod för att uppskatta den totala ligninhalten i växtbiomassan. Denna metod uppskattar ligninhalten genom att bilda tioeter med bensylalkoholgrupperna av lignin, som är lösliga under alkaliska förhållanden och olösliga under sura förhållanden. Det totala lignininnehållet uppskattas med hjälp av en standardkurva som genereras från kommersiellt bambu lignin.

Introduction

Lignin är en av de vitala bärande komponenterna i växtcellsväggar och den näst mest rikliga polymeren på jorden¹. Kemiskt är lignin en korslänkad heteropolymer som består av komplexa fenolföreningar med hög molekylvikt som utgör en naturlig förnybar källa till aromatiska polymerer och syntes av biomaterial^2,3. Denna naturliga polymer spelar betydande roller i växttillväxt, utveckling, överlevnad, mekaniskt stöd, cellväggsstelhet, vattentransport, mineraltransport, logibeständighet, vävnads- och organutveckling, nedfall av energi och skydd mot biotiska och abiotiska^{påfrestningar 4,5,6,7}. Lignin består huvudsakligen av tre olika monolignoler: barrträd, sinapyl och p-coumarylalkoholer som härrör från fenylpropanoidervägen^8,9. Mängden lignin och monomerernas sammansättning varierar beroende på växtart, vävnad/organtyp och olika stadier av växtutveckling¹⁰. Lignin klassificeras i stor utsträckning i barrved, lövträ och gräs lignin baserat på källan och monolignol sammansättning. Barrved består främst av 95% barrträalkohol med 4% p-coumaryl och 1% sinapylalkoholer. Lövträ har barrträd och sinapylalkoholer i lika stora proportioner, medan gräs lignin består av olika proportioner av barrträd, sinapyl och p-coumarylalkoholer^11,12. Sammansättningen av monomerer är kritisk eftersom den bestämmer ligninstyrkan, nedbrytningen och nedbrytningen av cellväggen samt bestämmer molekylär struktur, förgrening och korslänkning med andra polysackarider^13,14.

Ligninforskningen blir allt viktigare inom mädosök, textilindustri, pappersindustrier och för bioetanol, biobränsle och bioprodukter på grund av dess låga kostnad och höga^{överflöd 15,16}. Olika kemiska metoder (t.ex. acetylbromid, sura rengöringsmedel, Klason och permanganatoxidation) tillsammans med instrumentella metoder (t.ex. nära infraröd (NIR) spektroskopi, kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och ultraviolett (UV) spektroskopi) användes för lignin kvantifiering^9,17. Analysmetoderna för lignin klassificeras i allmänhet baserat på elektromagnetisk strålning, gravimetri och löslighet. Principen bakom ligninuppskattning genom elektromagnetisk strålning baserades på den kemiska egenskapen hos lignin genom vilken den absorberar ljus vid specifika våglängder. Dessa resultat uppskattades baserat på principen att lignin har en starkare UV-absorbans än kolhydrater. År 1962 använde Bolker och Somerville kaliumkloridpellets för att uppskatta ligninhalten i trä¹⁸. Denna metod har dock nackdelar med uppskattningen av ligninhalten från örtprover på grund av förekomsten av fenolföreningar som inte är lignin och avsaknaden av en lämplig utrotningskoefficient. År 1970 fann Fergus och Goring att guaiacyl- och syringylföreningens absorptionsmaximering var på 280 nm och 270 nm, vilket korrigerade utrotningskoefficientfrågan för Bolker och Somerville-metoden¹⁹. Senare användes infraröd spektroskopi, en mycket känslig teknik för karakterisering av fenolik, också för ligninuppskattning med en liten mängd växtbiomassaprover. Ett exempel på sådan teknik var diffus reflektans Fourier transform spektrofotometri. Denna metod saknar dock en korrekt standard som liknar UV-metoden²⁰. Senare uppskattades ligninhalten av NIRS (nära infraröd spektroskopi) och NMR (kärnmagnetisk resonansspektroskopi). Även om det finns nackdelar med dessa metoder, ändrar de inte den kemiska strukturen hos lignin, behåller sin renhet²⁰.

Den gravimetriska Klasonmetoden är en direkt och pålitlig analysmetod för ligninuppskattning av träiga stjälkar. Grunden för gravimetric lignin uppskattning är hydrolys/löslighet av icke-lignin föreningar och insamling av olösligt lignin för gravimetri²¹. I denna metod avlägsnas kolhydraterna genom hydrolys av biomassan med koncentrerad H₂SO_{4 för} att extrahera ligninrester^20,22. Den ligninhalt som uppskattas med denna metod kallas syralöslignin eller Klason lignin. Tillämpningen av Klason-metoden beror på växtarterna, vävnadstypen och cellväggstypen. Förekomsten av varierande mängder icke-ligninkomponenter såsom tanniner, polysackarider och proteiner leder till proportionella skillnader i uppskattningen av syralösligt/lösligt lignininnehåll. Därför rekommenderas Klason-metoden endast för ligninuppskattning av biomassa med hög ligninhalt som träiga^{stjälkar 17,23}. Löslighetsmetoder som acetylbromid (AcBr), syraolösligt lignin och tioglykolsyra (TGA) är de vanligaste metoderna för uppskattning av ligninhalten från olika växtbiomassakällor. Kim et al. etablerade två metoder för lignin utvinning genom löslighet. Den första metoden extraherar lignin som en olöslig rest genom att löslig cellulosa och hemicellulosa, medan den andra metoden separerar lignin i lösliga fraktioner, vilket lämnar cellulosa och hemicellulosa som olösliga rester²⁴.

Liknande metoder som används vid ligninuppskattning baserad på löslighet är tioglykolicsyra (TGA) och acetylbromid (AcBr)^{metoder 25}. Både TGA- och acetylbromidmetoder uppskattar ligninhalten genom att mäta absorbansen av det lösliga ligninet vid 280 nm. AcBr-metoden försämrar dock xylans under processen med ligninlöslighet och visar en felaktig ökning av lignininnehållet²⁶. Thioglycolate (TGA) metoden är den mer tillförlitliga metoden, eftersom den beror på specifik bindning med thioethergrupperna av bensylalkoholgrupper av lignin med TGA. TGA-bundet lignin fälls ut under sura förhållanden med HCl, och ligninhalten uppskattas med hjälp av dess absorbans vid 280 nm²⁷. TGA-metoden har ytterligare fördelar med mindre strukturella modifieringar, en löslig form av ligninuppskattning, mindre interferens från icke-ligninkomponenter och exakt uppskattning av lignin på grund av specifik bindning med TGA.

Denna TGA-metod modifieras baserat på den typ av växtbiomassaprov som används för uppskattning av ligninhalten. Här modifierade och anpassade vi den snabba TGA-metoden för rissugrör²⁷ till bomullsvävnader för att uppskatta ligninhalten. Kortfattat utsattes de torkade pulveriserade växtproverna för proteinlöslighetsbuffert och metanolextraktion för att avlägsna proteiner och den alkohollösliga fraktionen. Alkohol olösliga rester behandlades med TGA och fälls ut lignin under sura förhållanden. En lignin standardkurva genererades med kommersiell bambu lignin och en regressionslinje (y = mx +c) erhölls. Värdet “x” använder genomsnittliga absorbansvärden för lignin vid 280 nm, medan värdena “m” och “c” angavs från regressionslinjen för att beräkna okänd ligninkoncentration i biomassaprover för bomullsväxter. Denna metod är indelad i fem faser: 1) beredning av växtprover; 2) tvättning av proverna med vatten och metanol, 3) Behandling av pelleten med TGA och syra för att fälla ut lignin. 4) Utfällning av lignin. och 5) standardkurvberedningen och uppskattningen av ligninhalten i provet. De två första faserna är främst inriktade på växtmaterialberedningen följt av vatten, PSB (proteinlöslighetsbuffert) och metanolextraktioner för att erhålla alkohololösligt material. Sedan behandlades det med TGA (tioglykolic syra) och HCl att bilda ett komplex med lignin i den tredje fasen. I slutet användes HCl för att fälla ut lignin, som löstes upp i natriumhydroxid för att mäta dess absorbans vid 280 nm²⁸.

Protocol

1. Beredning av växtprover Samla två månader gamla bomullsplantor från växthuset (Figur 1A). Vänd växtkrukorna försiktigt för att separera jord och rötter med intakta sidorötter genom att lossa jorden runt växten (Figur 1B). Tvätta de uppsamlade växterna noggrant i brickor fyllda med vatten för att avlägsna all smuts (för rotprover) (Figur 1C). Använd pappershanddukar för at…

Representative Results

Två olika experimentella linjer i bomull jämfördes för skillnader i deras lignininnehåll i olika vävnader. Den extraherade ligninhalten i varje prov uppmättes till 280 nm och registrerade dess respektive absorbansvärden. De genomsnittliga absorbansvärdena för varje biologisk replikat jämfördes med regressionslinjen i ligninstandardkurvan(tabell 2, figur 3C). Regressionslinjen, y = mx + c, används för att beräkna den okända ligninhalten i de extraherade experi…

Discussion

Lignin spelar en viktig roll i växttillväxt och utveckling och har nyligen studerats i stor utsträckning för biobränsle-, bioenergi- och bioproduktapplikationer. Lignin är rikt på aromatiska föreningar som lagras i alla vaskulär växt sekundära cellväggar. Den har flera industriella applikationer som träpanelprodukter, biodispersiva medel, flocculants, polyuretanskum och i hartser av kretskort^29,30,31. Det mesta av d…

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples