Мы предоставляем пошаговый протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) в сердцах мышей.
Электрический сигнал, физиологически генерируемый клетками кардиостимулятора в синоатриальном узле (SAN), проводится через проводящую систему, которая включает в себя атриовентрикулярный узел (AVN), чтобы обеспечить возбуждение и сокращение всего сердца. Любая дисфункция SAN или AVN приводит к аритмиям, что указывает на их фундаментальную роль в электрофизиологии и аритмогенезе. Мышиные модели широко используются в исследованиях аритмии, но конкретное исследование SAN и AVN остается сложным.
SAN расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, а AVN расположен на вершине треугольника Коха, образованного отверстием коронарного синуса, трикуспидальным кольцом и сухожилием Тодаро. Однако из-за небольших размеров визуализация с помощью обычной гистологии остается сложной задачей и не позволяет изучать SAN и AVN в их 3D-среде.
Здесь мы описываем цельномонтный иммунофлуоресцентный подход, который позволяет локально визуализировать меченые мыши SAN и AVN. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание предназначено для небольших участков ткани без необходимости ручного сечения. С этой целью сердце мыши рассекают, удаляют нежелательные ткани с последующей фиксацией, пермеабилизацией и блокировкой. Затем клетки проводящей системы внутри SAN и AVN окрашивают антителом против HCN4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и обработка изображений позволяют дифференцировать узловые клетки и работающие кардиомиоциты, а также четко локализовать SAN и AVN. Кроме того, дополнительные антитела могут быть объединены для маркировки других типов клеток, таких как нервные волокна.
По сравнению с традиционной иммуногистологией, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание сохраняет анатомическую целостность сердечной проводящей системы, что позволяет исследовать AVN; особенно в их анатомии и взаимодействиях с окружающими рабочими клетками миокарда и немиоцитарными клетками.
Аритмии являются распространенными заболеваниями, поражающими миллионы людей, и являются причиной значительной заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на огромные успехи в лечении и профилактике, такие как разработка кардиостимуляторов, лечение аритмий остается сложным, в первую очередь из-за очень ограниченных знаний о механизмах основного заболевания 1,2,3. Лучшее понимание как нормальной электрофизиологии, так и патофизиологии аритмий может помочь разработать новые, инновационные и причинно-следственные стратегии лечения в будущем. Кроме того, для всестороннего изучения аритмогенеза важно локализовать и визуализировать конкретную систему сердечной проводимости на животных моделях, таких как мыши, поскольку мыши широко используются в электрофизиологических исследованиях.
Основными частями системы сердечной проводимости являются синоатриальный узел (SAN), где электрический импульс генерируется в специализированных клетках кардиостимулятора, и атриовентрикулярный узел (AVN), который является единственным электрическим соединением между предсердиями и желудочками4. Всякий раз, когда электрофизиологические свойства SAN и AVN изменяются, могут возникать аритмии, такие как синдром больного синуса или атриовентрикулярная блокада, которые могут привести к ухудшению гемодинамики, обмороку и даже смерти, и, таким образом, подчеркнуть существенную роль как SAN, так и AVN в электрофизиологии и аритмогенезе5.
Комплексные исследования SAN или AVN требуют точной локализации и визуализации обеих структур, в идеале в их физиологической среде. Однако из-за их небольших размеров и расположения в пределах рабочего миокарда, без установления четкой макроскопически видимой структуры, изучение анатомии и электрофизиологии SAN и AVN является сложной задачей. Анатомические ориентиры могут быть использованы для приблизительной идентификации области, содержащей SAN и AVN 6,7,8. Короче говоря, SAN расположен в межкавалевой области правого предсердия, прилегающей к мышечной crista terminalis (CT), AVN расположен в треугольнике Коха, установленном трикуспидальным клапаном, остиумом коронарного синуса и сухожилием Тодаро. До сих пор эти анатомические ориентиры в основном использовались для локализации, удаления, а затем изучения SAN и AVN как отдельных структур (например, с помощью обычной гистологии). Однако для лучшего понимания сложной электрофизиологии SAN и AVN (например, регуляторных эффектов соседних клеток рабочего миокарда) необходимо изучение проводящих систем в физиологической 3D-среде.
Полноуровневое иммунофлуоресцентное окрашивание представляет собой метод, который используется для изучения анатомических структур in situ при сохранении целостности окружающих тканей9. Используя преимущества конфокальной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений, SAN и AVN могут быть визуализированы с флуоресцентно мечеными антителами, нацеленными на ионные каналы, специально выраженные в этих областях.
Этот следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения хорошо зарекомендовавшего себя метода окрашивания цельным креплением для локализации и визуализации микроскопов SAN и AVN. В частности, этот протокол описывает, как (1) локализовать SAN и AVN анатомическими ориентирами для подготовки этих образцов к окрашиванию и микроскопическому анализу (2) выполнить полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание эталонных маркеров HCN4 и Cx43 (3) для подготовки образцов SAN и AVN для конфокальной микроскопии (4) для выполнения конфокальной визуализации SAN и AVN. Мы также описываем, как этот протокол может быть модифицирован, чтобы включить дополнительное окрашивание окружающего рабочего миокарда или немиоцитарных клеток, таких как автономные нервные волокна, что позволяет тщательно исследовать систему сердечной проводимости в сердце.
Анатомия сердца традиционно изучается с использованием тонких гистологических срезов11. Однако эти методы не сохраняют трехмерную структуру проводящей системы и, таким образом, предоставляют только 2D-информацию. Описанный здесь протокол иммунофлуоресцентного окрашиван?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb), Фондом Короны (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для H. Ishikawa-Ankerhold и S. Massberg и проект A10 для C. Schulz), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
Anesthesia | |||
Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
In vivo instrumentation | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
General lab instruments | |||
Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
Microscopes | |||
Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Software | |||
Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
General Lab Material | |||
0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
Chemicals | |||
0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
Agarose | Biozym | 850070 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
Drugs | |||
Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
Antibodies | |||
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
Other | |||
Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
Plasticine | Cernit | 49655005 | |
Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
Animals | |||
Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |