Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Summary

Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.

Abstract

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD), um processo ativo da doença que vai desde o espessamento leve da válvula até a calcificação grave, está associada à alta mortalidade, apesar de novas opções terapêuticas como a substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR).

As vias completas que começam com a calcificação da válvula e levam a estenose aórtica grave permanecem apenas parcialmente compreendidas. Ao fornecer uma representação atenta das células válvulas aórticas in vivo, o ensaio de linfócitos T a partir do tecido da válvula estenótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação. Após a excisão cirúrgica, a amostra fresca da válvula aórtica é dissecada em pequenos pedaços e os linfócitos T são cultivados, clonados e analisados por meio de triagem celular ativada de fluorescência (FACS).

O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados também podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os resultados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações nas concentrações de células T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subtipos específicos de células T de interesse. Neste estudo, mostramos o isolamento das células T, realizado em amostras de válvula aórtica calcificada fresca e as etapas de análise de clones de células T usando citometria de fluxo para entender melhor o papel da imunidade adaptativa na fisiopatologia cavd.

Introduction

A doença da válvula aórtica calcífica (CAVD) é uma das doenças mais comuns da válvula cardíaca, com forte impacto na assistência à saúde. A frequência de substituição da válvula aórtica nos últimos anos aumentou drasticamente e espera-se que aumente ainda mais, devido à crescente população ^idosa1.

A fisiopatologia subjacente do CAVD é apenas parcialmente conhecida e as estratégias terapêuticas atuais estão limitadas a medidas conservadoras ou substituição da válvula aórtica, seja através de procedimentos cirúrgicos ou percutâneos. Até o momento, nenhum tratamento médico eficaz pode dificultar ou reverter a progressão do CAVD e a alta mortalidade está associada ao início precoce dos sintomas, a menos que ^{seja realizada a} substituição da válvula aórtica (AVR). Em pacientes com estenose aórtica aórtica sintomática grave, a sobrevida sem sintomas de 3 anos foi relatada como baixa de 20%³. A substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR) representa uma nova opção, revolucionando o tratamento para pacientes de alto risco, especialmente entre os idosos e reduziu drasticamente a mortalidade, que era intrinsecamente alta nessa ^{população4,5,6}. Apesar dos resultados promissores do TAVR, novas pesquisas são necessárias para entender a fisiopatologia CAVD para identificar novos alvos terapêuticos precoces7,8,9.

Antes considerado um processo passivo e degenerativo, o CAVD é agora reconhecido como uma doença progressiva ativa, caracterizada por um interruptor de fenótipo osteoblástico das células intersticiais da válvula ^aórtica10. Esta doença envolve mineralização progressiva, alterações fibrocalcísicas e redução da motilidade dos folhetos da válvula aórtica (esclerose), que acabam por obstruir o fluxo sanguíneo levando ao estreitamento (estenose) da abertura da válvula ^aórtica11.

A inflamação é considerada um processo-chave na fisiopatologia CAVD, semelhante ao processo de aterosclerose vascular. A lesão endotelial permite a deposição e o acúmulo de espécies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas na válvula ^aórtica12. Essas lipoproteínas oxidadas provocam uma resposta inflamatória, por serem citotóxica, com a atividade inflamatória levando à mineralização. O papel da imunidade inata e adaptativa no desenvolvimento da CAVD e na progressão da doença foi recentemente ^destacado13. A ativação e a expansão clonal de subconjuntos específicos de células T de memória foram documentados em pacientes com CAVD e folhetos de válvulas aórticas mineralizados, de modo que os processos inflamatórios são assumidos como envolvidos pelo menos no desenvolvimento do CAVD e, presumivelmente, na progressão da doença ^também14. De fato, embora as células e macrófagos que apresentem antígenos estejam presentes tanto na válvula saudável quanto na doença, a presença de linfócitos T é indicativa de uma válvula aórtica envelhecida e doente. Este infiltrado linfocítico junto com um aumento na neovascularização e metaplasia são sinais histológicos característicos do ^CAVD15.

Nós hipótesemos a existência de uma interação entre as células interstices da válvula aórtica e a ativação do sistema imunológico, o que potencialmente desencadeia o início de um processo inflamatório crônico na válvula aórtica. O ensaio das células T a partir do tecido da válvula aórtica estótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação, pois pode fornecer uma representação próxima das células válvulas aórticas in vivo. No presente trabalho, utilizando tecido da válvula aórtica, isolamos linfócitos T, cultura e cloná-los, e posteriormente os caracterizamos usando a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS). Amostras frescas de válvulas aórticas foram excisadas de pacientes cavd que receberam substituição da válvula cirúrgica para estenose aórtica grave. Após a excisão cirúrgica, a amostra de válvula fresca foi dissecada em pequenos pedaços e as células T foram cultivadas, clonadas e então analisadas por citometria de fluxo. O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os dados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações na distribuição de linfócitos T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subconjuntos específicos de células T de interesse.

A extração de tecido calcificado, o isolamento de leucócitos do tecido calcificado e, particularmente, o uso de citometria de fluxo neste tipo de tecido podem ser desafiadores, devido a questões como a autofluorescência. Poucas publicações existem com protocolos para este propósito específico16,17,18. Aqui apresentamos um protocolo projetado especificamente para o isolamento direto e cultura do linfócito T a partir de amostras de válvulas aórticas humanas. A expansão clonal de linfócitos é uma marca registrada da imunidade adaptativa. Estudar esse processo in vitro fornece informações perspicazes sobre o nível de heterogeneidade linfócito19. Após um período de incubação de três semanas, os clones de células T estão prontos para serem explantados, pois uma quantidade adequada de células T de cada clone foi obtida, de modo a permitir o estudo fenotípico e funcional. Posteriormente, o fenótipo dos clones T é estudado por citofluorometria.

Este protocolo imunológico é uma adaptação de um método anteriormente desenvolvido pela Amedei et al. para isolamento celular T e caracterização do tecido humano, especialmente projetado para tecido humano calcificado, como em CAVD20,21,22. O protocolo aqui para o isolamento de PBMCs (células mononucleares de sangue periféricos) usando casaco de buffy irradiado descreve uma maneira eficaz de obter células alimentadoras (FC), especificamente ajustadas para a fase de clonagem de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula. A camada alimentador consiste em células presas em crescimento, que ainda são viáveis e bioativas. O papel das células alimentadoras é importante para apoiar a sobrevivência in vitro e o crescimento de linfócitos T isolados das células intersticiais da ^válvula23. Para evitar a proliferação de células alimentados na cultura, essas células devem sofrer uma parada de crescimento. Isso pode ser alcançado de duas maneiras: através de métodos físicos como a irradiação, ou através do tratamento com produtos químicos citotóxicos, como a mitomicina C (MMC), um antibiótico antitumoral que pode ser aplicado diretamente à superfície da ^cultura24. Aqui mostramos a prisão de crescimento celular alimentador alcançada através da irradiação celular.

Este método apresenta uma maneira eficiente e econômica de isolar e caracterizar células T a partir do tecido da válvula aórtica, contribuindo para a ampliação do espectro de métodos imunológicos para a exploração da fisiopatologia CAVD.

Protocol

O estudo foi realizado de acordo com o Estatuto do Charité para Assegurar boas Práticas Científicas e respeitadas as diretrizes legais e disposições sobre privacidade e ética. O Comitê de Ética aprovou todos os experimentos humanos e a privacidade e o anonimato dos pacientes foram mantidos de acordo com as regras relatadas no Formulário de Ética. NOTA: Para o protocolo descrito abaixo foram utilizadas amostras frescas de válvulas estenóticas humanas. 1. Pr…

Representative Results

Utilizamos um método simples e econômico para caracterizar a população leucócito de amostras frescas de válvulas aórticas derivadas de pacientes humanos com estenose de válvula aórtica grave (consulte o protocolo). O método de isolar os PBMCs é um passo vital na obtenção de células alimentadoras, que são usadas em todas as etapas do experimento (clonagem, realimentação e divisão de fases) e permitem a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Os passos-…

Discussion

Aqui apresentamos um método para caracterizar subpopulações de linfócitos T isoladas de amostras de válvulas aórticas esténticas, utilizando citometria de fluxo. Este método requer o uso de casaco de buffy irradiado para isolar os PBMCs. A frequência de radiação à qual os sacos de casacos buffy devem ser submetidos é 9000 Rad/90 Gray (Gy) e representa um passo crucial para parar a proliferação das células alimentadoras. O papel das células isoladas dos sacos de casacos buffy é agir apenas como células …

Materials

50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801