Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini
Summary
Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.
Abstract
La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è un metodo chiave nella ricerca pre-clinica sul morbo di Parkinson. Attualmente, il conteggio stereologico imparziale è lo standard per la quantificazione di queste cellule, ma rimane un processo laborioso e dispendioso in termini di tempo, che potrebbe non essere fattibile per tutti i progetti. Qui descriviamo l’uso di una piattaforma di analisi delle immagini, in grado di stimare con precisione la quantità di celle etichettate in una regione di interesse predefinita. Descriviamo un protocollo passo-passo per questo metodo di analisi nel cervello del ratto e dimostriamo che può identificare una significativa riduzione dei neuroni positivi tirosina idrossilasi a causa dell’espressione della α-sinuleina mutante nella substantia nigra. Abbiamo convalidato questa metodologia confrontando i risultati ottenuti da stereologia imparziale. Nel complesso, questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici, ed è quindi adatto per una determinazione efficiente dell’effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.
Introduction
Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo del movimento neurodegenerativo prevalente caratterizzato dalla presenza di aggregati proteici contenenti α-sinuleina (α-syn) e dalla perdita preferenziale di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantificazione del numero di neuroni dopaminergici è una parte vitale della ricerca PD in quanto consente la valutazione dell’integrità del sistema nigrostriatale, fornendo così un endpoint importante per valutare l’efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Attualmente, lo standard per la quantificazione del numero di cellule è il conteggio stereologico imparziale, che utilizza sezioni trasversali bidimensionali (2D) del tessuto per stimare le caratteristiche volumetriche nelle strutture tridimensionali (3D)2,3,4. I moderni metodi stereologici basati sulla progettazione utilizzano procedure di campionamento casuali complete e applicano protocolli di conteggio (noti come sonde) per evitare potenziali artefatti ed errori sistematici, consentendo un rilevamento affidabile delle differenze solo leggermente superiore alla variazione tra animali5. Mentre la stereologia fornisce un potente strumento analitico per studi istologici in vivo, richiede molto tempo, presuppone una preparazione uniforme del campione e richiede la convalida in diversi passaggi, il che può influire sull’efficienza sempre più richiesta per l’indagine traslazionale preclinale.
I recenti progressi tecnologici nella scienza digitale rendono possibile l’adozione di nuove applicazioni per valutazioni più efficienti della patologia senza stereomicroscopio, pur riempiendo un’esigenza di surrogato di stereologia imparziale. Questi metodi aumentano la velocità, riducono l’errore umano e migliorano la riproducibilità delle tecnichestereologiche 6,7. HALO è una di queste piattaforme di analisi delle immagini per l’analisi quantitativa dei tessuti nella patologia digitale. Comprende una varietà di moduli diversi e riporta dati di espressione morfologici e multiplexati su base cellulare per cella su intere sezioni tissutali utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli. Il modulo FL citonucleare misura la positività immunofluorescente dei marcatori fluorescenti nel nucleo o nel citoplasma. Ciò consente di segnalare il numero di celle positive per ogni marcatore e il punteggio di intensità per ogni cella. Il modulo può essere adattato per fornire le singole dimensioni cellulari e le misurazioni dell’intensità, anche se questa caratteristica non è necessaria per la quantificazione dei neuroni dopaminergici.
Lo scopo di questo studio è quello di verificare questo metodo con un modello di ratto α-syn basato su vettori virali precedentemente convalidato di neurodegenerazione nigrale8,9,10. In questo modello, il mutante umano A53T α-syn è espresso nell’SNpc per iniezione stereotassitica del sierotipo ibrido virus adeno-associato 1/2 (AAV1/2), con conseguente significativa neurodegenerazione per un periodo di 6 settimane. L’SNpc non iniettato contralaterale può, in alcuni studi, servire da controllo interno per il lato iniettato. Più comunemente, l’iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) in una coorte di controllo degli animali viene utilizzata come controllo negativo. Presentiamo una guida dettagliata per stimare la densità dei neuroni dopaminergici che rimangono nell’SNpc iniettato dopo 6 settimane utilizzando un software automatizzato di analisi delle immagini(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La valutazione affidabile dell’integrità del sistema dopaminergico nei modelli preclinali di PD è fondamentale per determinare l’efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Pertanto, è importante controllare e ridurre al minimo le potenziali confusioni che possono ridurre l’affidabilità e la riproducibilità dei dati istopatologici. Risultati quantitativi accurati possono fornire più informazioni rispetto alle sole descrizioni qualitative o semi-quantitative. Allo stesso tempo, dobbiamo riconoscer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano tutto lo staff dell’Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) di University Health Network per il loro tempo e la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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