Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse
Summary
Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.
Abstract
Die Abschätzung der Anzahl dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra ist eine Schlüsselmethode in der präklinischen Parkinson-Forschung. Derzeit ist die unvoreingenommene stereologische Zählung der Standard für die Quantifizierung dieser Zellen, aber es bleibt ein mühsamer und zeitaufwendiger Prozess, der möglicherweise nicht für alle Projekte durchführbar ist. Hier beschreiben wir den Einsatz einer Bildanalyseplattform, die die Menge der markierten Zellen in einem vordefinierten Interessenbereich genau abschätzen kann. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für diese Analysemethode im Rattengehirn und zeigen, dass es eine signifikante Reduktion der Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen aufgrund der Expression von mutiertem α-Synuclein in der Substantia nigra identifizieren kann. Wir validierten diese Methodik durch Vergleich mit Ergebnissen, die durch unvoreingenommene Stereologie erzielt wurden. Zusammengenommen bietet diese Methode einen zeiteffizienten und genauen Prozess zur Erkennung von Veränderungen der dopaminergen Neuronenzahl und eignet sich somit für die effiziente Bestimmung der Wirkung von Interventionen auf das Zellüberleben.
Introduction
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine weit verbreitete neurodegenerative Bewegungsstörung, die durch das Vorhandensein von Proteinaggregaten gekennzeichnet ist, die α-Synuclein (α-syn) enthalten, und den bevorzugten Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Die Quantifizierung der dopaminergen Neuronenzahl ist ein wesentlicher Bestandteil der PD-Forschung, da sie die Bewertung der Integrität des nigrostriatalen Systems ermöglicht und somit einen wichtigen Endpunkt zur Beurteilung der Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika darstellt. Derzeit ist der Standard für die Quantifizierung der Zellzahl die unvoreingenommene stereologische Zählung, die zweidimensionale (2D) Querschnitte von Gewebe verwendet, um volumetrische Merkmale in dreidimensionalen (3D) Strukturenabzuschätzen 2,3,4. Moderne designbasierte stereologische Methoden verwenden umfassende Stichprobenverfahren und wenden Zählprotokolle (sogenannte Sonden) an, um potenzielle Artefakte und systematische Fehler zu vermeiden, so dass Unterschiede, die nur geringfügig größer sind als die Variation zwischen den Tieren, zuverlässig erkannt werdenkönnen 5. Während die Sterologie ein leistungsfähiges Analysewerkzeug für histologische In-vivo-Studien darstellt, ist sie zeitintensiv, setzt eine einheitliche Probenvorbereitung voraus und erfordert eine Validierung in mehreren Schritten, was sich auf die Effizienz auswirken kann, die zunehmend für präklinische translationale Untersuchungen erforderlich ist.
Jüngste technologische Fortschritte in der digitalen Wissenschaft ermöglichen es, neuartige Anwendungen für effizientere Beurteilungen der Pathologie ohne Stereomikroskop zu übernehmen und gleichzeitig den Bedarf als Ersatz für unvoreingenommene Stereologie zu decken. Diese Methoden erhöhen die Geschwindigkeit, reduzieren menschliche Fehler und verbessern die Reproduzierbarkeit stereologischer Techniken6,7. HALO ist eine solche Bildanalyseplattform für die quantitative Gewebeanalyse in der digitalen Pathologie. Es besteht aus einer Vielzahl verschiedener Module und berichtet morphologische und multiplexte Expressionsdaten auf Zell-für-Zell-Basis über ganze Gewebeschnitte mit Hilfe von Mustererkennungsalgorithmen. Das zytonukleäre FL-Modul misst die immunfluoreszierende Positivität von fluoreszierenden Markern im Zellkern oder Zytoplasma. Dies ermöglicht die Meldung der Anzahl der positiven Zellen für jeden Marker und des Intensitätswerts für jede Zelle. Das Modul kann angepasst werden, um individuelle Zellgrößen und Intensitätsmessungen bereitzustellen, obwohl diese Funktion für die Quantifizierung dopaminerger Neuronen nicht erforderlich ist.
Ziel dieser Studie ist es, diese Methode mit einem zuvor validierten viralen Vektor-basierten α-Syn-Rattenmodell der nigralen Neurodegeneration8,9,10zu verifizieren. In diesem Modell wird die humane Mutante A53T α-syn im SNpc durch stereotaktische Injektion von Adeno-assoziiertem Virus-Hybrid-Serotyp 1/2 (AAV1/2) exprimiert, was zu einer signifikanten Neurodegeneration über einen Zeitraum von 6 Wochen führt. Das kontralaterale unausgestoßene SNpc kann in einigen Studien als interne Kontrolle für die injizierte Seite dienen. Häufiger wird die Injektion von AAV-Empty Vector (AAV-EV) in eine Kontrollkohorte von Tieren als Negativkontrolle verwendet. Wir präsentieren eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Abschätzung der Dichte dopaminerger Neuronen, die nach 6 Wochen im injizierten SNpc verbleiben, mit einer automatisierten Bildanalysesoftware (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zuverlässige Beurteilung der Integrität des dopaminergen Systems in präklinischen Modellen der Parkinson-Krankheit ist entscheidend, um die Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika zu bestimmen. Daher ist es wichtig, potenzielle Verrenkungen zu kontrollieren und zu minimieren, die die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit histopathologischer Daten verringern können. Sorgfältige quantitative Ergebnisse können mehr Informationen liefern als qualitative oder semi-quantitative Beschreibunge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken allen Mitarbeitern der Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) des University Health Network für ihre Zeit und Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neurosciences. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neurosciences. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
