Analys av översättning i den utvecklande mushjärnan med polysome profilering
Summary
Utvecklingen av däggdjurshjärnan kräver korrekt kontroll av genuttryck på översättningsnivå. Här beskriver vi ett polysome profileringssystem med en lättmonterade sackarosgradienttillverknings- och fraktioneringsplattform för att bedöma mRNAs translationella status i den utvecklande hjärnan.
Abstract
Den korrekta utvecklingen av däggdjurshjärnan bygger på en fin balans mellan neural stamcellsproliferation och differentiering i olika neurala celltyper. Denna balans styrs tätt av genuttryck som finjusteras på flera nivåer, inklusive transkription, post-transkription och översättning. I detta avseende belyser en växande mängd bevis en kritisk roll av translationell reglering i samordningen av neurala stamcell öde beslut. Polysome fraktionering är ett kraftfullt verktyg för bedömning av mRNA translationell status på både globala och individuella gennivåer. Här presenterar vi en in-house polysome profilering pipeline för att bedöma translationell effektivitet i celler från den utvecklande mus hjärnbarken. Vi beskriver protokollen för sackaros gradient beredning, vävnad lysis, ultracentrifugation och fraktionering-baserade analys av mRNA translationell status.
Introduction
Under utvecklingen av däggdjurshjärnan förökar neurala stamceller och differentierar för att generera nervceller och glia1,2 . Störningen av denna process kan leda till förändringar i hjärnans struktur och funktion, som ses i många neurodevelopmental störningar3,4. Det korrekta beteendet hos neurala stamceller kräver orkestrerat uttryck för specifika gener5. Medan den epigenetiska och transkriptionella kontrollen av dessa gener har studerats intensivt, tyder nya resultat på att genreglering på andra nivåer också bidrar till samordningen av neural stamcellsproliferation och differentiering6,7,8,9,10. Således, ta itu med translationella kontroll program kommer kraftigt att främja vår förståelse av mekanismerna bakom neurala stamcell öde beslut och hjärnans utveckling.
Tre huvudtekniker med olika styrkor har tillämpats i stor utsträckning för att bedöma översättningsstatusen för mRNA, inklusive ribosomprofilering, översättning av ribosom affinitet rening (TRAP) och polysome profilering. Ribosomprofilering använder RNA-sekvensering för att bestämma ribosomskyddade mRNA-fragment, vilket gör det möjligt att jämföra den globala analysen av antalet och platsen för översättning av ribosomer på varje transkript för att indirekt härleda översättningshastigheten genom att jämföra den med transkriptförekomst11. TRAP drar nytta av epitopmärkta ribosomproteiner för att fånga ribosombundna mRNAs12. Med tanke på att de märkta ribosomala proteinerna kan uttryckas i specifika celltyper med hjälp av genetiska metoder, tillåter TRAP analys av översättning på ett celltypspecifikt sätt. I jämförelse ger polysome profilering, som använder sackaros densitet gradient fraktionering för att separera fri och dåligt översatt del (lättare monosomer) från de som aktivt översätts av ribosomer (tyngre polysomes), en direkt mätning av ribosomtäthet på mRNA13. En fördel som denna teknik erbjuder är dess mångsidighet att studera översättningen av specifika mRNA av intresse samt genomomfattande översättningsanalys14.
I detta dokument beskriver vi ett detaljerat protokoll av polysome profilering för att analysera den utvecklande mus hjärnbarken. Vi använder ett hemmonterat system för att förbereda sackarosgradienter och samla in fraktioner för nedströmsapplikationer. Protokollet som presenteras här kan enkelt anpassas för att analysera andra typer av vävnader och organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome profilering är en vanligt förekommande och kraftfull teknik för att bedöma translationell status på både enda gen och genom-wide nivåer14 . I den här rapporten presenterar vi ett protokoll av polysome profilering med hjälp av en hemmonterad plattform och dess tillämpning för att analysera den utvecklande musbarken. Denna kostnadseffektiva plattform är lätt att montera och generera robusta, reproducerbara sackarosgradienter och polysomeprofilering med hög känslighet.
<p …Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av ett NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 till G.Y.). G.Y. är en kanadensisk forskningsordförande. S.K. finansierades av Mitacs Globalink Graduate Fellowship och ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
