Trasplante de islotes cubiertos de grasa utilizando tejido adiposo blanco epididimario

Summary

Este método de trasplante de islotes cubiertos de grasa es adecuado para la detección de islotes injertados en la cavidad intraperitoneal. En particular, no requiere el uso de agentes bioaglutinantes o suturas.

Abstract

El trasplante de islotes es una terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus grave. La cavidad intraperitoneal suele ser el sitio de trasplante para este procedimiento. Sin embargo, el trasplante de islotes intraperitoneales tiene algunas limitaciones, incluida la eficacia deficiente del trasplante, la capacidad de detección difícil del injerto y la falta de capacidad de injertectomía para el análisis posterior al trasplante. En este documento, el “trasplante de islotes cubiertos de grasa”, un método de trasplante de islotes intraperitoneales que utiliza tejido adiposo blanco epididimario, se utiliza para evaluar los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería. La simplicidad del método radica en la siembra de islotes en el tejido adiposo blanco del epidídimo y el uso del tejido para cubrir los islotes. Si bien este método se puede clasificar como una técnica de trasplante de islotes intraperitoneal, comparte características con el trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Sin embargo, el método de trasplante de islotes cubiertos de grasa demuestra efectos terapéuticos más sólidos que el trasplante de islotes de tejido intraadiposo, incluida la mejora de los niveles de glucosa en sangre e insulina plasmática y el potencial de extracción del injerto. Recomendamos la adopción de este método para evaluar los mecanismos de injerto de islotes en tejido adiposo blanco y los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería.

Introduction

El trasplante de islotes es una terapia de reemplazo celular para pacientes con diabetes mellitus grave. Informes recientes han demostrado que las tasas de independencia de la insulina a los tres años después del trasplante mejoran hasta un 44%¹ y que aproximadamente el 80% de los receptores que reciben más de 600.000 equivalentes totales de islotes logran la independencia de la insulina². Además, en el informe más reciente del Registro Colaborativo de Trasplantes de Islotes, se reveló que los niveles de glucosa en sangre en ayunas se mantuvieron en 60-140 mg / dL durante un período de 5 años en más del 70% de los pacientes que se sometieron solo a un trasplante de islotes. El estudio también determinó que alrededor del 90% de los pacientes que recibieron trasplante de islotes solo o trasplante de islotes después del trasplante de riñón no desarrollaron ningún evento hipoglucémico grave durante más de 5 años³.

Aunque los resultados clínicos de este tratamiento han ido mejorando, aún deben abordarse algunas limitaciones, incluida la necesidad de establecer un sitio de trasplante óptimo. El hígado es un sitio de trasplante típico para el trasplante clínico de islotes porque es el órgano más grande que puede acomodar un gran volumen de islotes. Sin embargo, en algunos pacientes el hígado no está disponible (p. ej., debido a hipertensión portal, hepatitis y/o cirrosis⁴) y, por lo tanto, otros sitios, incluyendo el espacio subcapsular renal^5,6, la bolsa omental 7,8,9,10, el mesenterio 11, el tracto gastrointestinal 12, el músculo esquelético 13, el tejido subcutáneo 13^, la médula ósea 14 y el bazo ¹⁵ ,^16,17, han sido considerados como sitios alternativos de trasplante.

Aunque el trasplante de islotes intraperitoneales se puede realizar fácilmente bajo anestesia local, lo que hace que la cavidad intraperitoneal sea un sitio atractivo para el trasplante clínico de islotes, después del trasplante, los islotes se dispersan por toda la cavidad intraperitoneal, lo que dificulta la detección del injerto de islotes y la confirmación exitosa del injerto. Por lo tanto, la cavidad intraperitoneal no es ampliamente reconocida como un sitio de trasplante clínico ideal. En cambio, se utiliza con frecuencia como modelo de control para estudios preclínicos para investigar la efectividad de los islotes encapsulados^{trasplantados 18} y los islotes de bioingeniería¹⁹. Sin embargo, es difícil lograr una comparación exacta entre la bioingeniería y los islotes de control debido a los desafíos para realizar una evaluación precisa del injerto.

En contraste, el uso de tejido adiposo blanco intraperitoneal en la bolsa omental⁸, mesenterio y otras localizaciones extrahepáticas ha sido bien reportado 10,20,21,22,23 y muchos de los estudios que investigaron la función de los islotes de bioingeniería trasplantados usando tejido adiposo blanco pudieron reportar resultados terapéuticos prometedores ^{20,24,25, 26}. Como el uso de tejido adiposo epididimario facilita la detección de islotes trasplantados, se desarrolló el “método de trasplante de islotes cubiertos de grasa”, que utiliza tejido adiposo epididimario, para superar las limitaciones del trasplante de islotes intraperitoneales. En este trabajo, se describe el trasplante de islotes cubiertos de grasa utilizando tejido adiposo epididimario.

Protocol

El siguiente procedimiento se realiza en tres pasos. El primer paso incluye la inducción de diabetes en los ratones receptores y el aislamiento de los islotes donantes. El segundo paso implica la preparación de los islotes antes del trasplante. En el tercer paso, se realiza el trasplante de islotes en el tejido adiposo epididimario y el recubrimiento de los islotes utilizando el tejido adiposo. Después de eso, se evaluaron los efectos terapéuticos. El manejo de los ratones y los procedimientos experimentales realizad…

Representative Results

Para comparar la eficacia del trasplante del trasplante de islotes cubiertos de grasa con la del trasplante intraperitoneal de islotes, se implantó el mismo número de islotes en el peritoneo en el espacio paracólico izquierdo de los animales diabéticos receptores de control. Se observó que los niveles de glucosa en sangre de ratones con trasplante de islotes cubiertos de grasa disminuyeron gradual y significativamente en comparación con los ratones trasplantados con islotes intraperitoneales (p = 0,0023; <strong cl…

Discussion

El método de trasplante de islotes cubiertos de grasa incorpora técnicas de dos técnicas de trasplante diferentes: trasplante de islotes intraperitoneales y trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Como la membrana superficial del tejido adiposo blanco del epidídimo se considera el tejido adiposo blanco que está cubierto por el peritoneo y que está unido al epidídimo, el método de trasplante de islotes cubierto de grasa se puede clasificar anatómicamente como un tipo de trasplante de islotes intraperitoneal…

Materials

4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor