Fetttäckt ötransplantation med epididymal vit fettvävnad

Summary

Denna fetttäckta ötransplantationsmetod är lämplig för detektering av engraferade öar i intraperitonealhålan. I synnerhet kräver det inte användning av biobindande medel eller suturering.

Abstract

Ötransplantation är en cellulär ersättningsterapi för svår diabetes mellitus. Den intraperitoneala håligheten är vanligtvis transplantationsstället för denna procedur. Intraperitoneal ötransplantation har dock vissa begränsningar, inklusive dålig transplantationseffekt, svår transplantatdetekteringsförmåga och brist på graftektomiförmåga för analys efter transplantation. I detta dokument används “fetttäckt ötransplantation”, en intraperitoneal ötransplantationsmetod som använder epididymal vit fettvävnad, för att bedöma de terapeutiska effekterna av biotekniska öar. Metodens enkelhet ligger i sådd av holmar på epididymal vit fettvävnad och användning av vävnaden för att täcka holmarna. Även om denna metod kan kategoriseras som en intraperitoneal ötransplantationsteknik, delar den egenskaper med intra-fettvävnadsötransplantation. Den fetttäckta ötransplantationsmetoden visar dock mer robusta terapeutiska effekter än vävnadstransplantation inom fettvävnad, inklusive förbättring av blodsocker- och plasmainsulinnivåer och potentialen för borttagning av transplantat. Vi rekommenderar antagandet av denna metod för att bedöma mekanismerna för ö-engraftment i vit fettvävnad och de terapeutiska effekterna av biotekniska öar.

Introduction

Ötransplantation är en cellulär ersättningsterapi för patienter med svår diabetes mellitus. Nya rapporter har visat att graden av insulinoberoende vid tre år efter transplantation förbättras upp till 44%¹ och att cirka 80% av mottagarna som får mer än 600 000 totala ösekvivalenter uppnår insulinoberoende². Dessutom, i den senaste Collaborative Islet Transplant Registry-rapporten, avslöjades att fastande blodsockernivåer bibehölls vid 60-140 mg / dL under en period av 5 år hos över 70% av patienterna som genomgick ötransplantation ensam. Studien fastställde också att cirka 90% av patienterna som fick ötransplantation ensam eller ö-transplantation efter njurtransplantation inte utvecklade några allvarliga hypoglykemiska händelser på över 5 år³.

Även om de kliniska resultaten av denna behandling har förbättrats måste vissa begränsningar fortfarande åtgärdas, inklusive behovet av att upprätta ett optimalt transplantationsställe. Levern är en typisk transplantationsplats för klinisk ötransplantation eftersom det är det största organet som rymmer en hög volym holmar. Hos vissa patienter är dock levern inte tillgänglig (t.ex. på grund av portalhypertension, hepatit och/eller cirros⁴) och därför andra ställen, inklusive det renala subkapsulära utrymmet^5,6, omental påse 7,8,9,10, mesenteri 11, mag-tarmkanalen 12, skelettmuskulaturen 13, subkutan vävnad 13^, benmärg 14 och mjälte ¹⁵ ,^16,17, har övervägts som alternativa transplantationsställen.

Även om intraperitoneal ötransplantation lätt kan utföras under lokalbedövning, vilket gör det intraperitoneala hålrummet till en tilltalande plats för klinisk ötransplantation, sprids öarna vid transplantation genom hela intraperitonealhålan, vilket gör det svårt att upptäcka ö-engraftment och framgångsrik engraftmentbekräftelse. Därför är det intraperitoneala hålrummet inte allmänt erkänt som en idealisk klinisk transplantationsplats. Istället används det ofta som en kontrollmodell för prekliniska studier för att undersöka effektiviteten hos transplanterade inkapslade¹⁸ och biotekniska öar¹⁹. En exakt jämförelse mellan biotekniska och kontrollöar är dock svår att uppnå på grund av utmaningarna med att utföra en korrekt engraftmentbedömning.

Däremot har användningen av intraperitoneal vit fettvävnad i omental påse⁸, mesenteri och andra extrahepatiska platser rapporterats väl 10,20,21,22,23 och många av de studier som undersöker funktionen hos biotekniska öar transplanterade med vit fettvävnad kunde rapportera lovande terapeutiska resultat ^{20,24,25, 26}. Eftersom användningen av epididymal fettvävnad underlättar detekteringen av transplanterade öar, utvecklades den “fetttäckta ötransplantationsmetoden”, som använder epididymal fettvävnad, för att övervinna begränsningarna för intraperitoneal ötransplantation. I detta dokument beskrivs fetttäckt ötransplantation med epididymal fettvävnad.

Protocol

Följande procedur utförs i tre steg. Det första steget inkluderar induktion av diabetes hos mottagarmössen och isolering av donatoröar. Det andra steget innebär beredning av öar före transplantation. I det tredje steget utförs ötransplantation på epididymal fettvävnad och täckning av öarna med hjälp av fettvävnaden. Därefter bedömdes de terapeutiska effekterna. Hanteringen av mössen och de experimentella procedurer som utförs i denna studie överensstämmer med ” Principles of Laboratory Animal Care …

Representative Results

För att jämföra transplantationseffekten av fetttäckt ötransplantation med den efter intraperitoneal ötransplantation implanterades samma antal öar på bukhinnan vid det vänstra parakoliska utrymmet hos kontrollmottagarens diabetesdjur. Blodsockernivåerna hos möss med fetttäckt ötransplantation observerades gradvis och signifikant minska jämfört med intraperitoneala ötransplanterade möss (p = 0,0023; Figur 3A). En månad efter transplantationen bibehölls blodsockret hos mös…

Discussion

Den fetttäckta ötransplantationsmetoden innehåller tekniker från två olika transplantationstekniker: intraperitoneal ötransplantation och intrafettvävnadsötransplantation. Eftersom ytmembranet av epididymal vit fettvävnad anses vara den vita fettvävnaden som täcks av bukhinnan och som är fäst vid epididymis, kan den fetttäckta ötransplantationsmetoden anatomiskt kategoriseras som en typ av intraperitoneal ötransplantation. Tekniken genom vilken holmarna levereras till mottagardjuret liknar dock mer de som…

Materials

4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor