Visualisera lungcellsanpassningar under kombinerad ozon- och LPS-inducerad murin akut lungskada
Summary
Kombinerade ozon- och bakteriella endotoxinexponerade möss uppbar bred celldöd, inklusive neutrofiler. Vi observerade cellulära anpassningar såsom störningar av cytoskeletal lamellipodia, ökat cellulära uttryck av komplexa V ATP syntas underavdelning β och angiostatin i broncho-alveolar lavage, undertryckande av lung immun svar och fördröjd neutrophil rekrytering.
Abstract
Lungor står ständigt inför direkta och indirekta förolämpningar i form av sterila (partiklar eller reaktiva toxiner) och infektiösa (bakteriella, virala eller svamp) inflammatoriska tillstånd. En överväldigande värd svar kan resultera i komprometterad andning och akut lungskada, som kännetecknas av lung neutrophil rekrytering som ett resultat av pato-logiska värd immun, koagulativ och vävnad remodeling svar. Känsliga mikroskopiska metoder för att visualisera och kvantifiera cellulära anpassningar av murin lungor, som svar på ozon med låg dos (0,05 ppm), en potent miljöförorening i kombination med bakteriell lipopolysackarid, en TLR4-agonist, är avgörande för att förstå värdens inflammatoriska mekanismer och reparationsmekanismer. Vi beskriver en omfattande fluorescerande mikroskopisk analys av olika lungor och systemiska kroppsfack, nämligen broncho-alveolar lavage vätska, lung vaskulär perfusate, vänster lung cryosections och sternal benmärg perfusate. Vi visar skador på alveolära makrofager, neutrofiler, lungparenkymal vävnad, liksom benmärgsceller i samband med ett fördröjt (upp till 36-72 h) immunsvar som kännetecknas av diskreta kemokingradienter i de analyserade facken. Dessutom presenterar vi lungextracellulära matris och cellulära cytoskeletala interaktioner (aktin, tubulin), mitokondriell och reaktiv syre art, anti-koagulativ plasminogen, dess anti-angiogenic peptid fragment angiostatin, mitokondriell ATP syntas komplexa V underenheter, α och β. Dessa surrogatmarkörer, när de kompletteras med adekvata in vitro-cellbaserade analyser och in vivo-djuravbildningstekniker som intravital mikroskopi, kan ge viktig information för att förstå lungsvaret på nya immunmodulerande medel.
Introduction
Akut lungskada (ALI) är ett avgörande patologiskt svar från lungor på infektiösa eller andra skadliga stimuli som kännetecknas av samtidig aktivering av koagulerings-, fibrinolytiska och medfödda immunsystem1. Neutrofiler känner omedelbart av mikrobiella såväl som intracellulära skademönster genom den tollliknande receptorn (TLR)familjen 2,3,4. Neutrofiler frigör förformade cytokiner och cytotoxiskt granulatinnehåll, vilket sedan kan orsaka skador på vävnaden. Den efterföljande alveolära skadan är kantad med sekundär celldöd som leder till frisättning av molekyler som adenosin triphosphate (ATP)5, vilket sätter in en ond cirkel av immun-dysregulation.
Ett olöst problem i förståelsen av ALI gäller frågan om hur skadan initieras inom alveolarmembranet. Elektrontransportkomplexet V, F1F0 ATP-syntas, är ett mitokondriellt protein som är känt för att uttryckas allestädes närvarande, på cell (inklusive endotel, leukocyt, epitelialt) plasmamembran under inflammation. Cellcytoskeletonen som består av aktin och tubulin, har många cellforms- och funktionsmodulerande samt mitokondriella proteiner. Vi har nyligen visat att blockad av ATP-syntasen av en endogen molekyl, angiostatin, tystar neutrofilrekrytering, aktivering och lipopolysackarid (LPS) inducerad lunginflammation6. Således kan både biokemiska (ATP-syntas) och immunmekanismer (TLR4) reglera alveolärbarriären under lunginflammation.
Exponering för ozon (O3),en miljöförorening, försämrar lungfunktionen, ökar mottagligheten för lunginfektioner, och korta låga nivåer av O3-exponeringar ökar risken för dödlighet hos personer med underliggande kardiorespiratoriskatillstånd 7,8,9,10,11,12,13,14. Exponering för fysiologiskt relevanta koncentrationer av O3 ger således en meningsfull modell av ALI för att studera grundläggande mekanismer för inflammation7,8. Vårt labb har nyligen etablerat en murinmodell av låg dos O3 inducerad ALI15. Efter att ha utfört en dos och tidssvar på låga O3 koncentrationer observerade vi att exponering för 0,05 ppm O3 för 2 h inducerar akut lungskada som kännetecknas av lunga ATP syntas komplexa V underavdelning β (ATPβ) och angiostatin uttryck, liknar LPS modellen. Intravital lung imaging visade disorganization av alveolar aktin mikrofilament som anger lungskador, och ablation av alveolära septala reaktiva syrearter (ROS) nivåer (som indikerar överföring av baslinjecellsignalering) och mitokondriell membranpotential (som indikerar akut celldöd) efter 2 h exponering för 0, 05 ppm O315 som korrelerade med en heterogen lunga 18FDG retention16, neutrofil rekrytering och cytokinfrisättning, framför allt IL-16 och SDF-1α. Budskapet från våra senaste studier är att O 3 producerar exponentiellt högtoxicitet när den exponeras vid koncentrationer under de tillåtna gränserna på 0,063 ppm över 8 timmar (per dag) för mänsklig exponering. Det är viktigt att det inte finns någon klar förståelse för om dessa subkliniska O3-exponeringar kan modulera TLR4-medierade mekanismer såsom genom bakteriellt endotoxin17. Således studerade vi en dubbel-hit O3 och LPS exponering modell och observerade immun och icke-immun cellulära anpassningar.
Vi beskriver en omfattande fluorescerande mikroskopisk analys av olika lung- och systemiska kroppsutrymmen, nämligen broncho-alveolär lavagevätska (dvs. BAL) som tar prov på de alveolära utrymmena, lungvaskulärt perfusat (dvs. LVP) som tar prov på lungvaskulaturen och det alveolära septala interstitiumet i händelse av en komprometterad endotelbarriär, vänster lung cryosections, för att undersöka bosatta parenkymala och vidhäftande leukocyter kvar i den lavaged lungvävnaden , perifert blod som representerar de cirkulerande leukocyterna och sternal- och lårbensmärgper som provar de proximala och distala platserna för hematopoetisk cellmobilisering under inflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som presenteras i den aktuella studien belyser nyttan av multipel fackanalys för att studera flera cellulära händelser under lunginflammation. Vi har sammanfattat resultaten i tabell 2. Vi och många laboratorier har studerat murinsvaret på intranasal LPS-instillation, vilket kännetecknas av snabb rekrytering av lung neutrofiler, som toppar mellan 6-24 h varefter upplösningen sparkar in. Och nyligen har vi visat att subkliniska O3 (vid 0,05 ppm för 2 h) ensam kan inducera bet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning som bedrivs finansieras av presidentens NSERC-anslag samt startfonder från Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finansieras av Innovation Saskatchewan. Fluorescensavbildning utfördes vid WCVM Imaging Centre, som finansieras av NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) och Manpreet Kaur (MSc Student) finansierades av start-up-medlen från Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochimie. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
