Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.
Betrouwbare genexpressiecontrole in zoogdiercellen vereist hulpmiddelen met een hoge vouwverandering, weinig ruis en bepaalde input-to-output overdrachtsfuncties, ongeacht de gebruikte methode. In de richting van dit doel hebben optogenetische genexpressiesystemen het afgelopen decennium veel aandacht gekregen voor spatiotemporale controle van eiwitniveaus in zoogdiercellen. De meeste bestaande circuits die lichtgeïnduceerde genexpressie regelen, variëren echter in architectuur, worden uitgedrukt uit plasmiden en maken gebruik van variabele optogenetische apparatuur, waardoor de noodzaak ontstaat om karakterisering en standaardisatie van optogenetische componenten in stabiele cellijnen te onderzoeken. Hier biedt de studie een experimentele pijplijn van betrouwbare gencircuitconstructie, integratie en karakterisering voor het beheersen van licht-induceerbare genexpressie in zoogdiercellen, met behulp van een negatieve feedback optogenetisch circuit als voorbeeld. De protocollen illustreren ook hoe het standaardiseren van optogenetische apparatuur en lichtregimes op betrouwbare wijze gencircuitkenmerken kan onthullen, zoals genexpressieruis en eiwitexpressiegrootheid. Ten slotte kan dit artikel van nut zijn voor laboratoria die niet bekend zijn met optogenetica en die dergelijke technologie willen toepassen. De hier beschreven pijplijn zou van toepassing moeten zijn op andere optogenetische circuits in zoogdiercellen, waardoor een betrouwbaardere, gedetailleerdere karakterisering en controle van genexpressie op transcriptioneel, proteomisch en uiteindelijk fenotypisch niveau in zoogdiercellen mogelijk is.
Net als andere technische disciplines heeft synthetische biologie tot doel protocollen te standaardiseren, waardoor hulpmiddelen met zeer reproduceerbare functies kunnen worden gebruikt voor het verkennen van vragen die relevant zijn voor biologische systemen1,2. Een domein in de synthetische biologie waar veel controlesystemen zijn gebouwd, is het gebied van genexpressieregulatie3,4. Genexpressiecontrole kan zich richten op zowel eiwitniveaus als variabiliteit (ruis of variatiecoëfficiënt, CV = σ/μ, gemeten als de standaarddeviatie over het gemiddelde), die cruciale cellulaire kenmerken zijn vanwege hun rol in fysiologische en pathologische cellulaire toestanden5,6,7,8. Veel synthetische systemen die eiwitniveaus en ruis4,9,10,11,12 kunnen regelen, zijn ontworpen, waardoor mogelijkheden ontstaan om protocollen voor alle tools te standaardiseren.
Een nieuwe set hulpmiddelen die gennetwerken kunnen besturen die onlangs zijn ontstaan, is optogenetica, waardoor het gebruik van licht mogelijk is om genexpressie te regelen13,14,15,16,17. Net als hun chemische voorgangers kunnen optogenetische gencircuits in elk celtype worden geïntroduceerd, variërend van bacteriën tot zoogdieren, waardoor elk stroomafwaarts gen van belang kan worden uitgedrukt18,19. Vanwege de snelle generatie van nieuwe optogenetische hulpmiddelen zijn er echter veel systemen ontstaan die variëren in genetische circuitarchitectuur, expressiemechanisme (bijv. Plasmide-gebaseerde versus virale integratie) en lichtleverende controleapparatuur11,16,20,21,22,23,24,25 . Daarom laat dit ruimte voor standaardisatie van optogenetische kenmerken zoals gencircuitconstructie en -optimalisatie, methode van systeemgebruik (bijv. Integratie versus voorbijgaande expressie), experimentele hulpmiddelen die worden gebruikt voor inductie en analyse van resultaten.
Om vooruitgang te boeken bij het standaardiseren van optogenetische protocollen in zoogdiercellen, beschrijft dit protocol een experimentele pijplijn om optogenetische systemen in zoogdiercellen te engineeren met behulp van een negatief feedback (NF) gencircuit geïntegreerd in HEK293-cellen (menselijke embryonale niercellijn) als voorbeeld. NF is een ideaal systeem om standaardisatie aan te tonen, omdat het zeer overvloedig aanwezig is26,27,28 in de natuur, waardoor eiwitniveaus kunnen worden afgestemd en ruisminimalisatie kan optreden. Kortom, NF maakt nauwkeurige genexpressiecontrole mogelijk door een repressor die zijn eigen expressie voldoende snel vermindert, waardoor elke verandering weg van een steady state wordt beperkt. De steady state kan worden veranderd door een inductor die de repressor inactiveert of elimineert om meer eiwitproductie mogelijk te maken totdat een nieuwe steady state is bereikt voor elke inductorconcentratie. Onlangs is een ontwikkeld NF-optogenetisch systeem gecreëerd dat een breed-dynamische respons van genexpressie kan produceren, lage ruis kan behouden en kan reageren op lichtstimuli, waardoor het potentieel voor ruimtelijke genexpressiecontrole11. Deze hulpmiddelen, bekend als licht-induceerbare tuners (LITers), werden geïnspireerd door eerdere systemen die genexpressiecontrole in levende cellen mogelijk maakten4,10,29,30 en werden stabiel geïntegreerd in menselijke cellijnen om langdurige genexpressiecontrole te garanderen.
Hier, met behulp van de LITer als voorbeeld, wordt een protocol geschetst voor het creëren van lichtresponsieve gencircuits, het induceren van genexpressie met een Light Plate Apparatus (LPA, een optogenetische inductiehardware)31, en het analyseren van reacties van de gemanipuleerde, optogenetisch bestuurbare cellijnen op aangepaste lichtstimuli. Met dit protocol kunnen gebruikers de LITer-tools gebruiken voor elk functioneel gen dat ze willen verkennen. Het kan ook worden aangepast voor andere optogenetische systemen met verschillende circuitarchitecturen (bijv. Positieve feedback, negatieve regulatie, enz.) door de hieronder beschreven methoden en optogenetische apparatuur te integreren. Vergelijkbaar met andere synthetische biologieprotocollen, kunnen de video-opnames en optogenetische protocollen die hier worden beschreven, worden toegepast in eencellige studies op verschillende gebieden, waaronder maar niet beperkt tot kankerbiologie, embryonale ontwikkeling en weefseldifferentiatie.
Lezers van dit artikel kunnen inzicht krijgen in de stappen die van vitaal belang zijn voor het karakteriseren van optogenetische gencircuits (evenals andere genexpressiesystemen), waaronder 1) ontwerp, constructie en validatie van gencircuits; 2) celtechnologie voor het introduceren van gencircuits in stabiele cellijnen (bijv. Flp-FRT-recombinatie); 3) inductie van de gemanipuleerde cellen met een op licht gebaseerd platform zoals de LPA; 4) initiële karakterisering van lichtinductietests via fluorescentiemicroscopie; …
The authors have nothing to disclose.
We willen balázsi lab bedanken voor opmerkingen en suggesties, Dr. Karl P. Gerhardt en Dr. Jeffrey J. Tabor voor het helpen bouwen van de eerste LPA, en Dr. Wilfried Weber voor het delen van de LOV2-degron plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R35 GM122561 en T32 GM008444]; Het Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; en een National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Financiering voor open access-kosten: NIH [R35 GM122561].
Bijdragen van de auteur: M.T.G. en G.B. bedachten het project. M.T.G., D.C., en L.G., voerden de experimenten uit. M.T.G., D.C., L.G., en G.B. analyseerden de gegevens en bereidden het manuscript voor. G.B. en M.T.G. begeleidden het project.
0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |