Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.
Asetillenmiş histone proteinleri, bir mutant kodlayan Escherichia coli’de kolayca ifade edilebilir, Nε-asetil-lizin (AcK)-spesifik Methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ve onun konyak tRNA (tRNAPyl)siteye özgü asetillenmiş histonları ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek için. MmAcKRS1 ve tRNAPyl, Escherichia coli’deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA’daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sağlar. Bu teknik, H3 lizin sahalarında ACK’yı dahil etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Pyrrolysyl-tRNA sentezi (PylRS) ayrıca bölgeye özgü protein modifikasyonu veya fonksiyonelleştirme için diğer nonkanonik amino asitleri (ncAA’lar) içerecek şekilde kolayca geliştirilebilir. Burada MmAcKRS1 sistemini kullanarak AcK’yı histone H3’e dahil etmek ve asetillenmiş H3 proteinlerini yeniden inşa edilmiş mononükleozomlara entegre etmek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Asetillenmiş yeniden inşa edilmiş mononükleozomlar biyokimyasal ve bağlayıcı tahlillerde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilir. Modifiye mononükleozomların elde edilmesi, yeni etkileşimler keşfetmek ve epigenetiği anlamakla ilgili deneyler tasarlamak için çok önemlidir.
Biz sentezlemek ve siteye özgü asetillelenmiş histonlar ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek içinPylRS ve tRNA Pyl kullandık. PylRS, post translational modifikasyonlara (PTM) sahip proteinler üretmek için genetik kod genişletme aracı olarak paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır ve genetik olarak yaklaşık 200 farklı nTA’yı içerecek şekilde evrimleştirilmiştir. PylRS, çeviri sırasında diğer amino asitlerden kaynaklanan rekabeti ortadan kaldırarak kehribar stop kodonuna dahil olur. PylRS ilk olarak metanojenik arkealarda keşfedilmiştir ve o zamandan beri kimyasal biyolojide yeni reaktif kimyasal grupları proteinlere dahil etmek için1,2.
MmAcKRS1, Methanosarcina mazei PylRS’den evrimleşmiştir ve laboratuvarımızda asetillenmiş proteinlerin sentezi için sıklıkla3, 4,5,6. MmAcKRS1, Escherichia coli’deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA’daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sunar. Bu teknik daha önce K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 ve K79 histone H3 lizin sitelerinde Sirtuin 1, 2, 6 ve 7’nin asetilasyonlu mononükleozomlar4,5,6üzerindeki aktivitesini incelemek için kullanılmıştır. Burada asetillenmiş histonları ifade etmek ve asetillenmiş nükleozomları yeniden inşa etmek için bu yöntemi detaylandırıyoruz.
Bir deney sırasında bu protokolü her ayrıntıya uymak önemlidir. Nükleozomlar çok kararlı değildir ve bu protokolün belirlenmesinde çok fazla deneme yanılma olmuştur. Partiküller montaj işlemlerine kolayca müdahale edebileceğinden, her adımda (veya gözlendiği zaman) çökeltileri kaldırmak anahtardır. Her zaman ton örneklerini buzda tut. Nükleozomlar 4 °C’de çok uzun süre saklanırsa, kendiliğinden sökülebilirsiniz. Herhangi bir denemede kullanılmadan önce 2 haftadan uzun bir süre 4 °C’d…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Wesley Wang’a bu protokole ve değerli akıl hocalığına zemin hazırlayıp verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GrantS R01GM127575 ve R01GM121584) ve Welch Foundation (Grant A-1715) tarafından desteklendi.
0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
100x TE Buffer | NA | NA | |
2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
Acetyllysine | |||
Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
Elution Buffer | NA | NA | |
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
His-TEV protease | |||
Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
petDUET-His-TEV-H2A | |||
petDUET-His-TEV-H2B | |||
petDUET-His-TEV-H3 | |||
pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
Thermocycler |