Colorazione, visualizzazione e analisi di papille gustative fungiformi, circumvallate e palato

Summary

Questo documento descrive i metodi per la preparazione dei tessuti, la colorazione e l’analisi di intere papille gustative fungiformi, circumvallate e palato che producono costantemente papille gustative intere e intatte (comprese le fibre nervose che le innervano) e mantengono le relazioni tra le strutture all’interno delle papille gustative e la papilla circostante.

Abstract

Le papille gustative sono raccolte di cellule che trasducono il gusto specializzate per rilevare sottoinsiemi di stimoli chimici nella cavità orale. Queste cellule trasduttrici comunicano con le fibre nervose che trasportano queste informazioni al cervello. Poiché le cellule che trasducono il gusto muoiono continuamente e vengono sostituite durante l’età adulta, l’ambiente delle papille gustative è sia complesso che dinamico, richiedendo analisi dettagliate dei suoi tipi di cellule, delle loro posizioni e di eventuali relazioni fisiche tra di loro. Le analisi dettagliate sono state limitate dall’eterogeneità e dalla densità lingua-tessuto che hanno ridotto significativamente la permeabilità degli anticorpi. Questi ostacoli richiedono protocolli di sezionamento che si traducono nella divisione delle papille gustative tra le sezioni in modo che le misurazioni siano solo approssimate e le relazioni cellulari vadano perse. Per superare queste sfide, i metodi qui descritti comportano la raccolta, l’imaging e l’analisi di intere papille gustative e singoli pergole terminali da tre regioni del gusto: papille fungiformi, papille circumvallate e palato. La raccolta di papille gustative intere riduce i pregiudizi e la variabilità tecnica e può essere utilizzata per riportare numeri assoluti per caratteristiche tra cui il volume delle papille gustative, l’innervazione totale delle papille gustative, la conta delle cellule trasduttrici e la morfologia dei singoli pergole terminali. Per dimostrare i vantaggi di questo metodo, questo documento fornisce confronti tra le papille gustative e i volumi di innervazione tra le papille gustative fungiformi e circumvallate utilizzando un marcatore generale delle papille gustative e un’etichetta per tutte le fibre gustative. Viene inoltre fornito un flusso di lavoro per l’uso dell’etichettatura genetica a cellule sparse dei neuroni del gusto (con sottoinsiemi etichettati di cellule che trasducono il gusto). Questo flusso di lavoro analizza le strutture dei singoli pergolati del nervo del gusto, i numeri di tipo cellulare e le relazioni fisiche tra le cellule utilizzando un software di analisi delle immagini. Insieme, questi flussi di lavoro forniscono un nuovo approccio per la preparazione dei tessuti e l’analisi sia di intere papille gustative che della morfologia completa dei loro pergole innervanti.

Introduction

Le papille gustative sono raccolte di 50-100 cellule epiteliali specializzate che legano sottoinsiemi di stimoli chimico-gustativi presenti nel cavo orale. Si ritiene generalmente che le cellule che trasducono il gusto esistano come tipi^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,}inizialmente sulla base di criteri di microscopia elettronica che sono stati successivamente correlati con marcatori molecolari. Le cellule di tipo II esprimono fosfolipasi C-beta 2 (PLCβ2)² e canale cationico potenziale del recettore transitorio, sottofamiglia M membro^{5 1} e comprendono cellule che trasducono dolce, amaro e umami^1,10. Le cellule di tipo III esprimono anidrasi carbonica 4 (Car4)¹¹ e proteina 25⁸ associata sinaptosomiale e denotano cellule che rispondono principalmente al gusto aspro¹¹. Le cellule che trasducono la salsedine non sono state così chiaramente delineate^12,13,14,ma potrebbero potenzialmente includere le cellule di tipo I, tipo II e III^{15,16,17,18,19.} L’ambiente gustativo è complesso e dinamico, dato che le cellule che trasducono il gusto si trasformano continuamente per tutta l’età adulta e sono sostituite da progenitori basali^3,20,21. Queste cellule che trasducono il gusto si collegano alle fibre nervose pseudo-unipolari dai gangli genicolati e petrosali, che passano le informazioni sul gusto al tronco cerebrale. Questi neuroni sono stati principalmente classificati in base al tipo di informazioni sul gusto che portano^22,23 perché le informazioni sulla loro morfologia sono state sfuggenti fino a poco tempo fa²⁴. Le cellule di tipo II comunicano con le fibre nervose tramite la proteina ionica modulatore dell’omeostasi del calcio^{1 canali ionici 25,}mentre le cellule di tipo III comunicano tramite le sinapsi classiche^8,26. Un’ulteriore caratterizzazione delle cellule delle papille gustative, compresi i lignaggi di tipo cellulare trasduttore, i fattori che influenzano la loro differenziazione e le strutture dei pergole di collegamento sono tutte aree di indagine attiva.

Gli studi sulle papille gustative sono stati ostacolati da diverse sfide tecniche. I tessuti eterogenei e densi che compongono la lingua riducono significativamente la permeabilità anticorpale per l’immunoistochimica^27,28,29. Questi ostacoli hanno reso necessari protocolli di sezionamento che si traducono nella divisione delle papille gustative tra le sezioni in modo che le misurazioni siano approssimate in base a sezioni rappresentative o sommate tra sezioni. In precedenza, le sezioni sottili rappresentative sono state utilizzate per approssimare sia i valori di volume che i conteggi delle celle trasduttori³⁰. Il sezionamento seriale più spesso consente l’imaging di tutte le sezioni di papille gustative e la somma delle misurazioni di ciascuna sezione³¹. Tagliare sezioni così spesse e selezionare solo papille gustative intere distorce il campionamento verso papille gustative più piccole^32,33,34. Le stime di innervazione nervosa delle papille gustative sezionate sono state basate su analisi dei numeri di pixel^13,35,se quantificati in tutto^36,37,38. Queste misurazioni ignorano completamente la struttura e il numero di singoli pergole nervose, perché i pergole sono divisi (e di solito scarsamente etichettati). Infine, sebbene la desquamazione dell’epitelio consenta di macchiare intere papille gustative^39,40,rimuove anche le fibre nervose delle papille gustative e potrebbe interrompere le normali relazioni tra le cellule. Pertanto, le indagini sulle relazioni strutturali all’interno delle papille gustative sono state limitate a causa di questa interruzione causata dagli approcci di colorazione.

La raccolta dell’intera struttura elimina la necessità di sezioni rappresentative e consente la determinazione di misurazioni a valori assoluti di volumi, conteggi cellulari e morfologie della struttura⁴¹. Questo approccio aumenta anche l’accuratezza, limita i pregiudizi e riduce la variabilità tecnica. Quest’ultimo elemento è importante perché le papille gustative mostrano una notevole variabilità biologica sia all’interno^{di 34,42} che tra le regioni^43,44e le analisi delle papille gustative intere consentono di confrontare i numeri assoluti delle cellule tra condizioni di controllo e sperimentali. Inoltre, la capacità di raccogliere papille gustative intatte consente l’analisi delle relazioni fisiche tra le diverse cellule trasducenti e le fibre nervose associate. Poiché le cellule che trasducono il gusto possono comunicare tra loro⁴⁵ e comunicare con le fibre nervose⁴⁶, queste relazioni sono importanti per la normale funzione. Pertanto, le condizioni di perdita di funzione potrebbero non essere dovute a una perdita di cellule, ma piuttosto a cambiamenti nelle relazioni cellulari. Qui è fornito un metodo per raccogliere intere papille gustative per ottenere i benefici delle misurazioni assolute per perfezionare le analisi del volume sia per le papille gustative che per le loro innervazioni, i conteggi e le forme delle cellule gustative e per facilitare le analisi delle relazioni trasduttore-cellula e delle morfologie nervo-pergolato. Due flussi di lavoro sono anche presentati a valle di questo nuovo metodo a monte intero per la preparazione dei tessuti: 1) per l’analisi del volume delle papille gustative e dell’innervazione totale e 2) per l’etichettatura genetica a cellule sparse dei neuroni del gusto (con sottoinsiemi di cellule che trasducono il gusto etichettate) e successive analisi della morfologia del pergolato del nervo del gusto, del numero di tipi di cellule del gusto e delle loro forme e l’uso di software di analisi delle immagini per analizzare le relazioni fisiche tra le cellule trasducenti e quelle trasduttori cellule e i loro pergole nervose. Insieme, questi flussi di lavoro forniscono un nuovo approccio alla preparazione dei tessuti e per l’analisi di intere papille gustative e la morfologia completa dei loro pergole innervanti.

Protocol

NOTA: Tutti gli animali sono stati curati in conformità con le linee guida stabilite dalla politica del servizio sanitario pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l’uso degli animali da laboratorio e dalla guida NIH per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. I topi Phox2b-Cre (ceppo MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) o i topi TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) sono stati allevati con topi reporter tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 sono stati al…

Representative Results

Colorazione dell’epitelio linguale con anticorpi contro dsRed e cheratina-8 (un marcatore generale delle papille gustative) etichettato sia come papille gustative intere che con tutta l’innervazione delle papille gustative nei topi Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (Figura 3A). L’imaging di queste papille gustative dai pori alle loro basi ha fornito immagini del piano x-y a più alta risoluzione (Figura 3A<strong…

Discussion

Lo sviluppo di un approccio per raccogliere e macchiare costantemente intere papille gustative da tre regioni del gusto della cavità orale (fungiforme, circumvallato e palato) fornisce miglioramenti significativi per l’analisi delle cellule che trasducono il gusto, il monitoraggio delle cellule appena incorporate, l’innervazione e le relazioni tra queste strutture. Inoltre, facilita la localizzazione di un potenziale marcatore neuronale secondario sia all’interno che all’esterno di una popolazione etichettata<sup class=…

Materials

2,2,2-Tribromoethanol	ACROS Organics	AC421430100
2-Methylbutane	ACROS	126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-007-003	15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson Immuno Research	712-605-150	(1:500)
AutoQuant X3 software	Media Cybernetics
Blunt End Forceps	Fine Science Tools	FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit	Molecular Probes	C10637	Follow kit instructions
Coverglass	Marienfeld	107242
Cytokeratin-8	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)	Troma1 supernatant	(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)	Roboz	RS-5619
Dissection Scissors (fine)	Moria	MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A21206	(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555	ThermoFisher Scientific	A31572	(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG	Jackson Immuno Research	805-477-008	(1:500)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glass slides	Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)	12-550-15
Goat anti-Car4	R&D Systems	AF2414	(1:500)
Imaris	Bitplane	pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer	MBF Biosciences	3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Normal Rabbit Serum	Equitech-Bio, Inc	SR30
Olympus FV1000		(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde	EMD	PX0055-3	4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed	Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)	632496	(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-206	(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP330-500
tert-Amyl alcohol	Aldrich Chemical Company	8.06193
Tissue Molds	Electron Microscopy Sciences	70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583
Triton X-100	BIO-RAD	#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit	ThermoFisher Scientific	Z25305	Follow kit instructions