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Neurosciences

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

Published: February 11, 2021
doi:
10.3791/62126
,
1Anatomical Sciences and Neurobiology,University of Louisville

Summary

本論文では、全体および無傷の味覚芽(それらを内面化する神経線維を含む)を一貫して生み出し、味覚芽内の構造と周囲の乳頭の構造間の関係を維持する全真菌形態、周回、口蓋味覚芽の組織調製、染色、分析の方法について説明する。

Abstract

味覚芽は、口腔内の化学刺激のサブセットを検出するために特化した味覚伝達細胞のコレクションです。これらの伝達細胞は、脳にこの情報を運ぶ神経線維と通信します。味覚伝達細胞は成人期を通じて絶えず死んで置換されるため、味覚芽環境は複雑で動的であり、細胞の種類、その位置、およびそれらの間の物理的な関係の詳細な分析を必要とします。詳細な分析は、抗体透過性を著しく低下させた舌組織の不均一性および密度によって制限されている。これらの障害は、測定が近似され、細胞の関係が失われるように、セクション間で味覚芽を分割するプロトコルを切り離す必要があります。これらの課題を克服するために、本明細書に記載されている方法は、真菌形態乳頭、乳頭の乳頭の周り、および口蓋の3つの味覚領域から全体の味覚芽および個々の末端アーバーを収集、イメージング、および分析することを含む。全体の味覚芽を収集すると、バイアスと技術的な変動を減らし、味覚芽のボリューム、総味覚芽のインナレーション、トランスデューシング細胞数、および個々の末端アーバーの形態を含む機能の絶対数を報告するために使用することができます。この方法の利点を実証するために、本論文は、一般的な味覚芽マーカーとすべての味覚繊維のラベルを使用して、真菌形態と味覚芽の間の味覚芽とインナレーション量の比較を提供する。味覚ニューロンのまばらな細胞遺伝的標識(味伝達細胞の標識されたサブセットを有する)の使用のためのワークフローも提供される。このワークフローは、画像解析ソフトウェアを用いて、個々の味覚神経の構造、細胞型数、細胞間の物理的関係を解析します。これらのワークフローは、組織の調製と全体の味覚芽とその内側のアーバーの完全な形態の分析のための新しいアプローチを提供します。

Introduction

味覚芽は、口腔内に存在する化学的味覚刺激のサブセットを結合する50〜100特殊上皮細胞のコレクションである。味移調細胞は、一般に、分子マーカーと相関していた電子顕微鏡基準に基づいて、タイプ1、2、3、4、5、6、7、8、9として存在すると考えられている。II型細胞は、ホスホリパーゼC-β2(PLCβ2)2および一過性受容体電位カチオンチャネルを発現し、サブファミリーMメンバー51および甘味、苦味、及び旨味1、10を透過する細胞が含まれる。III型細胞は炭酸脱水酵素4(Car4)11とシナプトソーム関連タンパク質258を発現し、酸味11に主に反応する細胞を示す。塩分を伝達する細胞は、12、13、14ほど明確に線引いがされていないが、タイプI、タイプII、タイプIII細胞15、16、17、18、19を含む可能性がある。味覚芽環境は複雑で動的であり、味覚伝達細胞が成人期を通じて継続的にひっくり返り、基底前駆細胞3、20、21に置き換えられることを考えると。これらの味伝達細胞は、脳幹に味覚情報を渡す原発性およびペトロサル神経節から擬似単極神経線維に接続する。これらのニューロンは、形態に関する情報が最近までとらえどころが見えなくなっていたため、主に22,23を運ぶ味覚情報の種類に基づいて分類されている。II型細胞はカルシウム恒常性調節薬タンパク質1イオンチャネル25を介して神経線維と通信するが、一方、III型細胞は古典的なシナプス8,26を介して通信する。細胞型系統の導入を含む味覚芽細胞のさらなる特徴付け、それらの分化に影響を与える因子、および連結アーバーの構造は、すべて活発な調査の分野である。

味覚芽の研究は、いくつかの技術的な課題によって妨げられています。舌を構成する異種および緻密な組織は、免疫組織化学27、28、29の抗体透過性を有意に低下させる。これらの障害には、セクション間で味覚芽が分割され、測定が代表的なセクションに基づいて近似されるか、セクション間で合計されるという切片プロトコルが必要です。これまでは、代表的な薄いセクションを使用して、体積値とトランスデューシングセル数30の両方を近似していました。より厚いシリアル断面化は、すべての味覚芽セクションのイメージングと、各セクション31からの測定値の合計を可能にする。このような厚いセクションを切断し、全体の味覚芽を選択すると、小さな味覚芽32、33、34に向かってサンプリングバイアス。切除された味覚芽からの神経の内挿推定値は、ピクセル数13、35の分析に基づいており、36、37、38で定量化した場合。これらの測定値は、アーバーが分割されるため(通常はラベルが不十分)ため、個々の神経アーバーの構造と数を完全に無視します。最後に、上皮を剥がすと味覚芽全体が39、40に染色されますが、味覚芽神経線維を取り除き、細胞間の正常な関係を混乱させる可能性があります。したがって、味覚芽内の構造的関係の調査は、染色アプローチによって引き起こされるこの混乱のために制限されています。

全構造コレクションは、代表的なセクションの必要性を排除し、容積、細胞数、および構造形態41の絶対値測定の決定を可能にする。このアプローチは、精度を高め、バイアスを制限し、技術的な変動性を低減します。味覚芽は、34、42、および領域間で43、44、および全体の味覚芽分析の両方でかなりの生物学的変動性を示すので、この最後の要素は重要であり、完全な細胞数を制御と実験条件の間で比較することができます。さらに、無傷の味覚芽を収集する能力は、異なる形容細胞とそれに関連する神経線維との間の物理的関係の分析を可能にする。味移し細胞は互いに45と通信し、神経線維46と通信することができるので、これらの関係は正常な機能にとって重要である。したがって、機能喪失条件は、細胞の損失によるものではなく、セル関係の変化によるものと考えられます。ここでは、味覚芽とその内因、味覚細胞の数と形状の両方のボリューム分析を精製するための絶対的な測定の利点を達成するために全体の味覚芽を収集し、およびトランスデューシング細胞の関係と神経アーバー形態の分析を促進するための方法を提供します。また、この新しい組織準備のための全型実装方法の下流に提示される:1)味覚芽量と総インナービネーションを分析するための1と2)味覚ニューロンのまばらな細胞遺伝的標識(味覚変容細胞のサブセットを標識)と、その後の味覚神経アーバー形態の分析、味覚細胞型の数とその形状の分析 細胞とその神経樹立。これらのワークフローは、組織の準備と全体の味覚芽の分析とその内側のアーバーの完全な形態に対する新しいアプローチを提供します。

Protocol

注:すべての動物は、米国公衆衛生サービスポリシーによる「人道的ケアと実験動物の使用」および「実験動物のケアと使用のためのNIHガイド」によって定められたガイドラインに従って世話を受けました。Phox2b-Creマウス(MMRRC株034613-UCD、NP91Gsat/Mmcd)またはTrkBCreERマウス(Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg)をtdTomatoレポーターマウス(Ai14)で飼育した。アドビリン・クロイアー<sup cla…

Representative Results

SSRedおよびケラチン-8に対する抗体によるリングアル上皮の染色(一般的な味覚芽マーカー)は、Phox2b-Cre:tdTomatoマウス50,51において味覚芽全体と全味覚芽の内インベーションの両方を標識した(図3A)。毛穴からそのベースにこれらの味覚芽をイメージングすると、最高解像度のx-y平面画像(図3A、B)…

Discussion

3つの口腔味覚領域(真菌形態、円周、口蓋)から味覚芽全体を一貫して収集し、染色するアプローチの開発は、味移し細胞を分析し、新たに組み込まれた細胞、インナーブ、およびこれらの構造間の関係を追跡するための重要な改善を提供する。さらに、標識母集団50の内部または外側の両方で潜在的な二次ニューロンマーカーの局在化を促進する。これは、特に、味乳頭が?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

カヴィスカ・クルパラナンタは、組織染色と周回味覚芽のイメージングへの貢献、乳頭へのインナーゼーションの染色とイメージングのためのジェニファー・シュー、動物のケアとジェノタイピングのためのカイティー・ホーン、柔らかい口蓋味の芽の組織染色に対するリクン・マに感謝します。このプロジェクトは、R21 DC014857とR01 DC007176からR.F.K、F31 DC017660からL.Oにサポートされました。

Materials

2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 
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Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).
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