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Neurosciences

곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 전체 마운트 염색, 시각화 및 분석

Published: February 11, 2021
doi:
10.3791/62126
,
1Anatomical Sciences and Neurobiology,University of Louisville

Summary

이 논문은 전체 및 그대로 미각 (내면의 신경 섬유 포함)을 일관되게 산출하고 미각과 주변 유두 내의 구조 사이의 관계를 유지하는 전체 곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 조직 준비, 염색 및 분석을위한 방법을 설명합니다.

Abstract

미각은 구강 내 화학 자극의 하위 집합을 검출하기 위해 특화된 미각 변환 세포의 모음입니다. 이 유도 세포는 두뇌에 이 정보를 전송하는 신경 섬유와 통신합니다. 맛을 유발하는 세포가 지속적으로 죽고 성년 내내 대체되기 때문에 미각 환경은 복잡하고 역동적이므로 세포 유형, 위치 및 신체 관계에 대한 상세한 분석이 필요합니다. 상세한 분석은 항체 투과성을 현저하게 감소시킨 혀 조직 이질성 및 밀도에 의해 제한되었습니다. 이러한 장애물은 측정이 근사화되고 세포 관계가 손실되도록 섹션 간에 미각을 분할하는 프로토콜을 필요로 합니다. 이러한 과제를 극복하기 위해, 본원에 설명된 방법은 곰팡이 유두, 둘레 유두 및 입맛의 세 가지 맛 부위에서 전체 미각 및 개별 말단 아버를 수집, 이미징 및 분석하는 것을 포함합니다. 전체 미각을 수집하는 것은 편견과 기술적 가변성을 감소시키며 미각 부피, 총 미각 내부, 트랜스듀싱 셀 수 및 개별 터미널 아버의 형태와 같은 기능에 대한 절대 숫자를 보고하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점을 입증하기 위해, 이 논문은 일반적인 미각 마커와 모든 미각 섬유에 대한 라벨을 사용하여 곰팡이 형태와 둘레 미각 사이의 미각과 내면의 볼륨의 비교를 제공합니다. 미각 뉴런의 희소세포 유전 라벨링(미각 유도 세포의 표지된 하위 세트)의 사용을 위한 워크플로우도 제공됩니다. 이 워크플로는 개별 미각 신경 식목, 세포 유형 번호 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 간의 물리적 관계를 분석합니다. 이러한 워크플로우는 전체 미뢰와 내면의 식목의 완전한 형태에 대한 조직 준비 및 분석을 위한 새로운 접근법을 제공합니다.

Introduction

미각은 구강에 존재하는 화학 맛 자극의 하위 집합을 결합하는 50-100 전문 상피 세포의 모음입니다. 미각 유도 세포는 일반적으로 유형1,2,3,4,5,6,7,8,9로존재하도록 생각되며, 처음에는 나중에 분자 마커와 상관관계가 있었던 전자 현미경 기준에 기초하여. 타입 II 세포는 인지질제 C-베타 2 (PLCβ2)2 및 과도 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M 부재 51을 발현하고 달콤하고 쓴 맛, 및 감칠맛1,10을트랜스듀싱하는 세포를 포함한다. 타입 III 세포는 탄산 안수분해 4 (Car4)11 및 시냅토소말 관련 단백질(258)을 발현하고 주로신맛(11)에반응하는 세포를 나타냅니다. 짠맛을 유발하는세포는12,13,14로명확하게 묘사되지 않았지만 잠재적으로 타입 I, 유형 II 및 타입 III 세포15,16,17,18,19를포함할 수 있다. 미각 환경은 맛을 유발하는 세포가 지속적으로 성인기에 걸쳐 인계되고 기저 선조3,20,21로대체된다는 점을 감안할 때 복잡하고 역동적입니다. 이러한 맛 을 유발하는 세포는 뇌간으로 맛 정보를 전달하는 유전자 절인 및 석유 신경교에서 의사 단극성 신경 섬유에 연결합니다. 이러한 뉴런은 주로22,23을 운반하는 맛 정보의 종류에 따라 분류되었습니다. 타입 II 세포는 칼슘 항상성 변조기 단백질 1 이온 채널25를통해 신경 섬유와 통신하는 반면, 타입 III 세포는 고전적인 시냅스를 통해통신8,26. 미각 세포의 추가 특성화-세포 형 혈통 을 변환 포함 하 여, 그들의 분화에 영향을 미치는 요인, 그리고 연결 식목의 구조는 모두 적극적인 조사의 영역.

미각 연구는 몇 가지 기술적 인 도전에 의해 방해되었습니다. 혀를 구성하는 이종및 조밀한 조직은 면역조직화학(27,28,29)에대한 항체 투과성을 현저히 감소시다. 이러한 장애물은 측정이 대표 섹션에 따라 근사되거나 섹션 전체에 걸쳐 합산되도록 섹션 에 걸쳐 미각을 분할하는 결과 단면 프로토콜이 필요합니다. 이전에는 대표적인 얇은 섹션이 볼륨 값과 트랜스듀싱 셀 수30을모두 근사화하는 데 사용되었습니다. 두꺼운 직렬 단면은 모든 미각 섹션의 이미징과 각 섹션31에서측정의 합산을 허용합니다. 이러한 두꺼운 섹션을 절단하고 전체 미각 바이어스 바이어스 샘플링 작은 미각을 향해 샘플링32,33,34. 단면 미각에서 신경 내선 추정은 픽셀 번호13,35,모든36,37,38에서정량화하는 경우의 분석을 기반으로합니다. 이러한 측정은 개별 신경 식목의 구조와 수를 완전히 무시합니다. 마지막으로, 상피를 벗겨내더라도 전체 미각이39,40으로얼룩지게 되고, 미각 신경 섬유를 제거하고 세포 간의 정상적인 관계를 방해할 수 있습니다. 따라서 미각 내의 구조적 관계에 대한 조사는 염색 접근법으로 인한 이러한 중단으로 인해 제한되었습니다.

전체 구조 컬렉션은 대표 섹션에 대한 필요성을 제거하고 볼륨, 셀 카운트 및 구조 형태(41)의절대 값 측정을 할 수 있습니다. 또한 이 방법은 정확도를 높이고 바이어스를 제한하며 기술적 변동성을 줄입니다. 이 마지막 요소는 미각이34,42및 지역43,44 내의 상당한 생물학적 가변성을 나타내기 때문에 중요하며 전체 미각 분석은 절대 세포 수를 제어 및 실험 조건 사이에서 비교할 수 있도록 합니다. 더욱이, 그대로 미각을 수집하는 능력은 다른 트랜스듀싱 세포와 그들의 관련 신경 섬유 사이의 물리적 관계의 분석을 허용한다. 미각 유도 세포는 서로 통신할 수 있기 때문에(45) 신경 섬유와 통신 할 수 있습니다(46)이러한 관계는 정상적인 기능에 중요하다. 따라서 기능 상실 조건은 세포의 손실 때문이 아니라 세포 관계의 변화로 인한 것일 수 있습니다. 여기에 제공 된 전체 미각을 수집하여 미각과 내면, 미각 세포 수 및 모양 모두에 대한 볼륨 분석을 정제하고 세포 관계 및 신경 아버 형태학의 분석을 촉진하기위한 절대 측정의 이점을 얻을 수 있습니다. 두 가지 워크플로우는 또한 조직 준비를위한이 새로운 전체 마운트 방법의 다운스트림을 제시한다 : 1) 미각 부피 및 총 내부 를 분석하기위한 2) 미각 뉴런의 희소 세포 유전 라벨링 (맛 변환 세포의 하위 세트) 및 맛 신경 아버 형태의 후속 분석, 맛 세포 유형과 그 모양 사이의 물리적 분석 사이의 이미지 분석 및 변환 사이의 이미지 분석 세포와 그들의 신경 수목. 이러한 워크플로우는 조직 준비와 전체 미뢰 분석 및 내면의 식목의 완전한 형태에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다.

Protocol

참고: 모든 동물은 미국 공중 보건 서비스 정책이 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 지침과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 보살핌을 받았습니다. Phox2b-Cre 마우스(MMRRC 균주 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) 또는 TrkBCreER 마우스(Ntrk2 tm3.1(cre/ERT2)Ddg)는tdTomato 리포터 마우스(Ai14)로 사육하였다. 애드빌린CreER47은 Phox2b-flpo4…

Representative Results

dsRed 및 각질-8(일반 미각 마커)에 대한 항체를 가진 언어 상피의 염색은 전체 미각과 Phox2b-Cre:tdTomato 마우스50,51 (그림 3A)의모든 미각 내부를 모두 표시하였다. 모공에서 기지까지 이러한 미각을 이미징하면 가장 높은 해상도의 X-y 평면이미지(그림 3A,B)가나타났습니다. 픽셀 기반 이미징 프로그램?…

Discussion

3개의 구강 맛 영역(곰팡이형태, 둘레 및 입맛)에서 전체 미각을 지속적으로 수집하고 얼룩지게 하는 접근법의 개발은 미각 변환 세포를 분석하고, 새로 통합된 세포를 추적하고, 이 구조물 사이의 관계를 추적하기 위한 상당한 개선을 제공한다. 또한, 표지된집단(50)의내부 또는 외부의 잠재적이 보조 뉴런 마커의 국소화를 용이하게 한다. 이것은 또한 몇몇 맛 신경세포를 표시할…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 조직 염색에 그녀의 기여와 외경 미각의 이미징에 대한 Kavisca Kuruparanantha에 감사드립니다, 유두에 내부의 염색및 이미징제니퍼 쉬, 동물 관리 및 genotyping케이티 혼, 부드러운 입맛 의 그녀의 조직 염색에 대한 리쿤 마. 이 프로젝트는 R21 DC014857 및 R01 DC007176에서 R.F.K 및 F31 DC017660에서 L.O까지 지원되었습니다.

Materials

2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 
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Citer Cet Article
Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).
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