Helfjellsfarging, visualisering og analyse av soppform, circumvallate og ganens smaksløker

Summary

Dette dokumentet beskriver metoder for vevsforberedelse, farging og analyse av hele soppform, omkrets og gane smaksløker som konsekvent gir hele og intakte smaksløker (inkludert nervefibrene som innervate dem) og opprettholder forholdet mellom strukturer innen smaksløker og den omkringliggende papillaen.

Abstract

Smaksløker er samlinger av smakstransduserende celler spesialisert for å oppdage undergrupper av kjemiske stimuli i munnhulen. Disse transduserende cellene kommuniserer med nervefibre som bærer denne informasjonen til hjernen. Fordi smakstransduserende celler kontinuerlig dør og erstattes gjennom hele voksen alder, er smaksløkmiljøet både komplekst og dynamisk, og krever detaljerte analyser av celletypene, plasseringene deres og eventuelle fysiske forhold mellom dem. Detaljerte analyser har vært begrenset av tungevevs heterogenitet og tetthet som har redusert antistoffpermeabiliteten betydelig. Disse hindringene krever seksjoneringsprotokoller som resulterer i å dele smaksløker på tvers av seksjoner, slik at målingene bare blir tilnærmet, og celleforhold går tapt. For å overvinne disse utfordringene innebærer metodene som er beskrevet her, å samle, forestille seg og analysere hele smaksløker og individuelle terminal arbors fra tre smaksregioner: soppform papillae, circumvallate papillae og ganen. Innsamling av hele smaksløker reduserer skjevheter og teknisk variasjon og kan brukes til å rapportere absolutte tall for funksjoner, inkludert smaksløkvolum, total smaksløkinning, transduseringscelleantall og morfologien til individuelle terminal arbors. For å demonstrere fordelene med denne metoden, gir dette papiret sammenligninger av smaksløk og innervasjonsvolumer mellom soppform og omskjære smaksløker ved hjelp av en generell smaksløkmarkør og en etikett for alle smaksfibre. En arbeidsflyt for bruk av sparsommelig celle genetisk merking av smaksnevroner (med merkede undergrupper av smakstransduserende celler) er også gitt. Denne arbeidsflyten analyserer strukturene til individuelle smak-nerve arbors, celle type tall, og de fysiske relasjonene mellom celler ved hjelp av bildeanalyse programvare. Sammen gir disse arbeidsflytene en ny tilnærming for vevsforberedelse og analyse av både hele smaksløker og den komplette morfologien til deres innervating arbors.

Introduction

Smaksløker er samlinger av 50-100 spesialiserte epitelceller som binder undergrupper av kjemisk smak stimuli tilstede i munnhulen. Smakstransduserende celler antas generelt å eksistere som type^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}, først basert på elektronmikroskopikriterier som senere ble korrelert med molekylære markører. Type II-celler uttrykker fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)² og forbigående reseptorpotensial kationkanal, underfamilie M medlem 5¹ og inkluderer celler som transduserer søt, bitter og umami^1,10. Type III-celler uttrykker karbonanhydrase 4 (Car4)¹¹ og synaptosomalt assosiert protein 25⁸ og betegner celler som hovedsakelig reagerer på sur smak¹¹. Cellene som transduserer salthet, er ikke like tydelig avgrenset^12,13,14, men kan potensielt inneholde cellene Type I, Type II og Type III^{15,16,17,18,19}. Smaksløkmiljøet er komplekst og dynamisk, gitt at smakstransduserende celler kontinuerlig snur gjennom voksen alder og erstattes av basale forfedre^3,20,21. Disse smakstransduserende cellene kobles til pseudo-unipolare nervefibre fra geniculatet og petrosale ganglia, som sender smaksinformasjon til hjernestammen. Disse nevronene har primært blitt kategorisert basert på den typen smaksinformasjon de bærer^22,23 fordi informasjon om deres morfologi har vært unnvikende til nylig²⁴. Type II celler kommuniserer med nervefibre via kalsium homeostase modulator protein 1 ion kanaler²⁵, mens Type III celler kommunisere via klassiske synapser^8,26. Videre karakterisering av smaksløkceller – inkludert transduserende celletypeavstamninger, faktorer som påvirker deres differensiering, og strukturene til å koble arbors er alle områder av aktiv undersøkelse.

Smaksløkstudier har blitt hindret av flere tekniske utfordringer. Det heterogene og tette vevet som utgjør tungen reduserer signifikant antistoffgjennomtrengelighet for immunhiistokjemi^27,28,29. Disse hindringene har nødvendiggjort seksjonsprotokoller som resulterer i splitting av smaksløker på tvers av seksjoner, slik at målingene enten tilnærmes basert på representative seksjoner eller summeres på tvers av seksjoner. Tidligere har representative tynne seksjoner blitt brukt til å tilnærme seg både volumverdier og transduseringscelleantall³⁰. Tykkere seriell seksjonering gir mulighet for avbildning av alle smaksløkseksjoner og summering av målinger fra hver seksjon³¹. Kutte slike tykke seksjoner og velge bare hele smaksløker fordommer prøvetaking mot mindre smaksløker^32,33,34. Nerveinnvandringsestimater fra seksjonerte smaksløker har vært basert på analyser av pikseltall^13,35, hvis kvantifisert i det hele tatt^36,37,38. Disse målingene ignorerer helt strukturen og antall individuelle nerve arbors, fordi arbors er delt (og vanligvis dårlig merket). Til slutt, selv om peeling bort epitelet tillater hele smaksløker å bli farget^39,40, fjerner det også smak-knopp nervefibre og kan forstyrre de normale forholdene mellom celler. Derfor har undersøkelser av de strukturelle forholdene innen smaksløker vært begrenset på grunn av denne forstyrrelsen forårsaket av fargingsmetoder.

Samling av hele strukturen eliminerer behovet for representative inndelinger og tillater bestemmelse av absolutte verdimålinger av volumer, celleantall og strukturmorfologier⁴¹. Denne tilnærmingen øker også nøyaktigheten, begrenser skjevheter og reduserer teknisk variasjon. Dette siste elementet er viktig fordi smaksløker viser betydelig biologisk variasjon både innenfor^34,42 og på tvers av region^43,44, og hele smaksløkanalyser gjør at absolutte cellenumre kan sammenlignes mellom kontroll og eksperimentelle forhold. Videre tillater evnen til å samle intakte smaksløker analysen av de fysiske forholdene mellom forskjellige transduserende celler og deres tilhørende nervefibre. Fordi smakstransduserende celler kan kommunisere med hverandre⁴⁵ og kommunisere med nervefibre⁴⁶, er disse forholdene viktige for normal funksjon. Dermed kan det hende at funksjonstapsbetingelser ikke skyldes tap av celler, men i stedet for endringer i cellerelasjoner. Gitt her er en metode for å samle hele smaksløker for å oppnå fordelene med absolutte målinger for raffinering av volumanalyser for både smaksløker og deres innerveringer, smakscelletall og former, og for å lette analyser av transduserende celleforhold og nerve-arbor morfologier. To arbeidsflyter presenteres også nedstrøms for denne nye helmonterte metoden for vevsforberedelse: 1) for å analysere smaksløkvolum og total innervasjon og 2) for sparsommelig celle genetisk merking av smaksnevroner (med undergrupper av smakstransduserende celler merket) og påfølgende analyser av smak-nerve arbor morfologi, antall smakscelletyper og deres former, og bruk av bildeanalyseprogramvare for å analysere de fysiske forholdene mellom transduserende celler og de mellom transduserende celler og deres nerve arbors. Sammen gir disse arbeidsflytene en ny tilnærming til vevsforberedelse og for analyser av hele smaksløker og fullstendig morfologi av deres innervating arbors.

Protocol

MERK: Alle dyrene ble tatt vare på i henhold til retningslinjene som er fastsatt i US Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals og NIH Guide for care and use of Laboratory Animals. Phox2b-Cre mus (MMRRC stamme 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) eller TrkBCreER mus (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) ble oppdrettet med tdTomato reporter mus (Ai14). AdvillinCreER47 ble oppdrettet med Phox2b-flpo48 og Ai65. For 5-eth…

Representative Results

Farging av det linguale epitelet med antistoffer mot dsRed og keratin-8 (en generell smaksløkmarkør) merket både hele smaksløkene og all smaksløkeinnvandring i Phox2b-Cre:tdTomato mus50,51 (Figur 3A). Avbildning av disse smaksløkene fra porene til basene ga de høyeste x-y-planbildene med høyest oppløsning (Figur 3A,B). Konturfunksjonen til det pikselbaserte bildebehandlingsprogr…

Discussion

Utviklingen av en tilnærming til konsekvent å samle og flekke hele smaksløker fra tre smaksregioner i munnhulen (soppform, omkrets og ganen) gir betydelige forbedringer for å analysere smakstransduserende celler, spore nyinkorporerte celler, innervasjon og relasjoner mellom disse strukturene. I tillegg letter det lokalisering av en potensiell sekundær neuronmarkør både innenfor eller utenfor en merket befolkning⁵⁰. Dette er spesielt relevant gitt at gustatory papillae også får robust soma…

Materials

2,2,2-Tribromoethanol	ACROS Organics	AC421430100
2-Methylbutane	ACROS	126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-007-003	15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson Immuno Research	712-605-150	(1:500)
AutoQuant X3 software	Media Cybernetics
Blunt End Forceps	Fine Science Tools	FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit	Molecular Probes	C10637	Follow kit instructions
Coverglass	Marienfeld	107242
Cytokeratin-8	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)	Troma1 supernatant	(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)	Roboz	RS-5619
Dissection Scissors (fine)	Moria	MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A21206	(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555	ThermoFisher Scientific	A31572	(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG	Jackson Immuno Research	805-477-008	(1:500)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glass slides	Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)	12-550-15
Goat anti-Car4	R&D Systems	AF2414	(1:500)
Imaris	Bitplane	pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer	MBF Biosciences	3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Normal Rabbit Serum	Equitech-Bio, Inc	SR30
Olympus FV1000		(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde	EMD	PX0055-3	4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed	Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)	632496	(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-206	(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP330-500
tert-Amyl alcohol	Aldrich Chemical Company	8.06193
Tissue Molds	Electron Microscopy Sciences	70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583
Triton X-100	BIO-RAD	#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit	ThermoFisher Scientific	Z25305	Follow kit instructions