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Abstract
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Neurosciences

급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

Published: August 11, 2021
doi:
10.3791/62127
, , ,
1Department of Medicine, School of Medicine,Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences,City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics,University of Florida College of Medicine

Summary

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

Abstract

모노 아민 신경 전달 물질은 수많은 신경 및 정신 질환과 관련 된. 이러한 조건의 동물 모델은 모노 아민 신경 전달 물질 릴리스 및 섭취 역학에 변화를 보여 주었다. 전기 생리학, 빠른 스캔 순환 볼탐법 (FSCV), 이미징, 생체 내 미세 투석, 광유전학 또는 방사능 사용과 같은 기술적으로 복잡한 방법은 모노아민 기능을 연구하는 데 필요합니다. 여기서 제시된 방법은 모노아민 방출을 검사하기 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용하여 급성 뇌 슬라이스에서 모노아민 방출을 검출하기 위한 최적화된 2단계 접근법이며, 모노아민 방출 측정을 위한 전기화학적 검출(HPLC-ECD)과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피입니다. 간략하게, 전두엽 피질, 해마 및 등삼 조각을 포함하는 관심 영역을 포함하는 쥐 뇌 단면은 조직 슬라이서 또는 진동을 사용하여 수득하였다. 관심의 이 지역은 전체 두뇌에서 해부되고 산소생리완에서 배양되었습니다. 생존력은 실험 시간 과정 전반에 걸쳐 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석으로 조사되었다. 급성 해부 된 뇌 영역은 수송기 (암페타민)를 통해 또는 외세포 성 성 혈관 방출 (KCl)의 활성화를 통해 모노 아민 방출을 유도하는 것으로 알려진 다양한 약물 조건에서 배양되었다. 인큐베이션 후, 슈퍼나탄에서 출시된 제품은 HPLC-ECD 시스템을 통해 수집 및 분석되었다. 여기에서, 기저 모노아민 방출은 급성 두뇌 조각에서 HPLC에 의해 검출됩니다. 이 데이터는 AMPH와 KCl이 모노아민 방출을 유도한다는 것을 보여주는 생체 내 및 체외 결과를 지원합니다. 이 방법은 모노아민 수송기 의존방출과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 특히 유용하며, 신속하고 저렴한 방식으로 모노아민 방출에 영향을 미치는 화합물을 선별할 수 있는 기회를 제공한다.

Introduction

신경 및 정신 질환의 과다 한 소화 장애 또는 단일 아민 신경 전달 물질의 부족 한 유지 보수와 관련 된 (도파민 [DA], 세로토닌 [5-HT], 노르 피 네 프 린 [NE]) 항상성1,2,3. 이러한 조건은 우울증을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다1,2, 정신 분열증, 불안2, 중독4, 폐경5,6,7, pain8, 및 파킨슨 병3. 예를 들면, 폐경의 몇몇 쥐 모형은 해마 내의 단색민의 난독증 또는 감소, 전두엽 피질 및 striatum가 폐경을 경험하는 여자에서 보인 불경기 및 인식 쇠퇴 둘 다와 연관될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 이 모형에 있는 monoamines의 dysregulation는 HPLC-ECD를 사용하여 광범위하게 검토되었습니다, 연구 결과는 신경 전달물질 릴리스 대 측정된 신경 전달물질 함량 사이에서 차별하지 않았지만 5,6,7. 모노아민은 고전적으로 Ca2+의존성 성 산하 제19을 통해 세포외 공간으로 방출되며, 각각의 플라즈마 멤브레인 재업 시스템(도파민 수송기, DAT; 세로토닌 수송기, SERT; 노르피네프린 수송기, NET)10,11을 통해 다시 재활용된다. 반대로, 데이터는 암페타민 (AMPH)과 3,4-메틸렌디옥시메탐페타민 (MDMA)과 같은 남용약물이 각각 수송 시스템을 통해 DA와 5-HT를 방출하는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 수송기는 모노아민을 방출하거나 efflux 할 수 있음을 시사합니다 16,16,167 . 따라서, 모노아민 방출 역학의 적절한 기계론적 이해는 특정 및 표적 약리요법을 개발하는 데 중요합니다.

빠른 스캔 사이클릭 볼탐법 (FSCV)18, 생체 내 미세 투석13, 이미징19, 방사선 표지 모노 아민20, 광유전학, 그리고 최근에는 유전적으로 색소로 인코딩된 형광 센서 및 광미측정221,221,211과 같은 모노아민 방출을 연구하기 위해 다양한 기술이 사용되었습니다. . FSCV 및 생체 내 마이크로 투석은 모노아민 방출을 연구하는 데 사용되는 주요 기술입니다. FSCV는 급성 뇌 슬라이스와 생체 내 DA의 자극된 외세포 방출을 연구하는 데 사용됩니다. FSCV는 방출을 자극하거나 깨우기 위하여 전극을 이용하기 때문에, 신경 전달물질 방출의 1차 근원은 Ca2+의존성 성혈관 방출18,24,25,26,27,28,29,30,31입니다 . HPLC와 결합 된 생체 내 미세 투약은 관심의 뇌 영역에 배치 된 프로브를 사용하여 세포 외 신경 전달 물질 수준에 변화를 측정13,32. FSCV와 유사, 생체 내 마이크로 투석에 대한 주요 제한은 신경 전달 물질 방출의 소스를 결정하는 어려움입니다 : Ca2+ 의존성 혈관 방출 또는 수송에 의존. 주목할 만하지만 두 방법 모두 모노아민 방출을 직접 측정할 수 있습니다. 최근 광유전학의 발전을 통해, 연구는 절묘한 세포 모형 특이성21,22와 짧은 기간에 있는 5-HT 및 DA 방출의 검출을 보여줍니다. 그러나, 이러한 전략은 복잡하고 비용이 많이 드는 기술과 장비를 필요로하고, 간접적으로 단일 아민 방출을 측정, 특히 수용체에 단일 아민 바인딩을 통해. 또한, 방사성 표지 모노아민은 또한 모노아민 역학을 연구하는 데 사용됩니다. 방사선 표지 모노아민은 각 모노아민 수송기 20,33,34,35,36,37,38,39,40, 1차 뉴런20, 시냅토좀3,39,41, 이종세포 와 같은 다양한 모델 시스템에 미리 로드될 수 있다. 42, 급성 뇌 슬라이스43,44. 그러나, 방사능은 실험자에게 잠재적인 해를 초래하고, 트리튬 라벨된 유리분해는 내인성 monoamine dynamics45,46을 충실하게 되풀이하지 않을 수 있습니다. HPLC-ECD와 같은 오프라인 검출 방법과 결합된 슈퍼퓨전 시스템은 여러 조직 소스에서 모노아민검출을 허용했습니다. 여기서 이 프로토콜은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 기저 및 자극된 모노아민 방출을 직접 측정하기 위해 최적화되고 저렴한 비용, 간단하고 정확한 방법을 제공합니다.

급성 뇌 슬라이스는 주로 생체 내 해부학 적 미세 환경을 보존할 때 기계론 적 가설을 테스트할 수 있으며, 그대로 시냅스47,48,49,50,51,52를 유지합니다. 몇 가지 연구에서, 급성 뇌 슬라이스 또는 다진 뇌 조직 Ca2+ 매개 릴리스를 자극 하는 KCl을 사용 하 여 과융합 기술과 함께 사용 되었습니다53,54,55,56. 과류 시스템은 모노아민을 포함한 신경 전달 물질 방출 메커니즘에 대한 현장의 이해를 증진하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 이들 시스템은 비교적 비싸며, 조직 분석에 사용할 수 있는 챔버의 수는 4-12사이이다. 이에 비해, 여기에 제시된 방법은 저렴하고, 48개의 조직 샘플을 측정할 수 있으며, 최대 96개의 조직 샘플을 사용하도록 정제될 수 있다. 48웰 플레이트 내에 있는 각 우물에는 필터를 사용하여 방출된 제품을 조직으로부터 분리하는 조직 홀더가 포함되어 있으며, 방출된 모노아민은 HPLC-ECD에 의해 수집 및 분석됩니다. 중요한 것은, 이 방법은 전두엽 피질, 해마 및 등쪽 줄무늬와 같은 다른 뇌 영역에서 5-HT, DA 및 NE 방출을 동시에 측정할 수 있도록 하는 약리학제제로 치료후 모노아민 방출을 조절한다. 따라서, 실험자는 테스트된 샘플의 수를 증가시켜 사용되는 동물의 수를 줄이는 저렴한 멀티웰 시스템을 사용하여 여러 질문에 답할 수 있다.

Protocol

동물 취급 및 조직 수집을 포함한 모든 실험은 플로리다 대학과 뉴욕 시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인 된 프로토콜 201508873 (UF) 및 1071 (CCNY)에 따라 수행되었습니다. 시약 및 버퍼의 경우 보충 파일을 참조하십시오. 1. 급성 쥐 뇌 슬라이스 준비 참고:이 실험에서 성인 수컷 쥐(250-350 g)가 사용하였다. 그러나, 이 설정은 다?…

Representative Results

이 기술은 내부 조직 홀더가있는 48 웰 플레이트에 기반을 둔 전기 화학 적 검출을 가진 HPLC를 사용하여 내인성 모아민의 방출을 측정하기 위해 뇌 슬라이스의 사용을 설명합니다. 실험 설정은 그림 1 과 도 2에 묘사됩니다. 초기에는 실험이 끝날 때까지 조직의 생존가능성을 보장하기 위해 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐?…

Discussion

모노아민 방출 측정은 이종 세포, 신경 배양, 뇌 시냅토좀, 전 생체 내 급성 뇌 슬라이스, 및 전체 동물 13,20,41,42,58,65,65,67,67,68 과 같은 여러 시스템에서 수년간 수행되었습니다.<sup class="…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 J.A.P.에 폰데시트 개시 기금 N 11191049, NIH는 G.E.T.에 DA038598을 보조금으로 지원했다.

Materials

48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer
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References

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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).
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