Denne metode introducerer en simpel teknik til påvisning af endogene monoamin frigivelse ved hjælp af akutte hjerne skiver. Opsætningen bruger en 48-brønd plade, der indeholder en vævsholder til monoamin frigivelse. Frigivet monoamin analyseres af HPLC kombineret med elektrokemisk detektion. Derudover, denne teknik giver en screening metode til opdagelse af lægemidler.
Monoamin neurotransmittere er forbundet med mange neurologiske og psykiatriske lidelser. Dyremodeller af sådanne forhold har vist ændringer i monoamin neurotransmitter frigivelse og optagelse dynamik. Teknisk komplekse metoder såsom elektrofysiologi, Hurtig ScanningCyclic Voltammetry (FSCV), billeddannelse, in vivo mikrodialyse, optogenetik, eller brug af radioaktivitet er påkrævet for at studere monoamin funktion. Metoden præsenteres her er en optimeret to-trins tilgang til påvisning af monoamin frigivelse i akutte hjerne skiver ved hjælp af en 48-brønd plade, der indeholder vævsholdere til undersøgelse af monoamin frigivelse, og højtydende flydende kromatografi kombineret med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) til monoamin frigivelse måling. Kort sagt blev rottehjerneafsnit, der indeholder områder af interesse, herunder præfrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum opnået ved hjælp af en vævsudsnitsbehandler eller vibratom. Disse interesseområder blev dissekeret fra hele hjernen og inkuberet i en iltet fysiologisk buffer. Levedygtigheden blev undersøgt i løbet af forsøgstiden ved 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akut dissekerede hjerneområder blev inkuberet under forskellige lægemiddelforhold, der vides at fremkalde monoaminfrigivelse gennem transportøren (amfetamin) eller gennem aktivering af eksocytotisk køretøjsfrigivelse (KCl). Efter inkubation blev de frigivne produkter i supernatanten indsamlet og analyseret gennem et HPLC-ECD-system. Her, basal monoamin frigivelse detekteres af HPLC fra akutte hjerne skiver. Disse data understøtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater, der viser, at AMPH og KCl fremkalder monoaminfrigivelse. Denne metode er især nyttig til at studere mekanismer forbundet med monoamin transporter-afhængige frigivelse og giver mulighed for at screene forbindelser, der påvirker monoamin frigivelse i en hurtig og billig måde.
En overflod af neurologiske og psykiatriske sygdomme er forbundet med dysregulering eller utilstrækkelig vedligeholdelse af monoamin neurotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homøostase1,2,3. Disse betingelser omfatter, men er ikke begrænset til, depression1,2, skizofreni2, angst2, afhængighed4, overgangsalderen5,6,7, pain8, og Parkinsons sygdom3. For eksempel har flere rottemodeller af overgangsalderen vist, at dysregulering eller reduktion af monoaminer inden for hippocampus, præfrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depression og kognitiv tilbagegang, som ses hos kvinder, der oplever overgangsalderen. Dysreguleringen af monoaminer i disse modeller er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af HPLC-ECD, selv om undersøgelserne ikke diskriminerede mellem målt neurotransmitterindhold versus neurotransmitter release5,6,7. Monoaminer er klassisk frigives i ekstracellulære rum gennem Ca2 +-afhængige køretøj frigivelse9, og genbruges tilbage gennem deres respektive plasmamembran re-optagelse system (dopamin transporter, DAT; serotonin transporter, SERT; noradrenalin transporter, NET)10,11. Omvendt tyder data på, at disse transportører er i stand til at frigive eller efflux monoaminer, da stoffer af misbrug såsom amfetamin (AMPH) og 3,4-Methylenedioxymethamfetamin (MDMA) er kendt for at frigive DA og 5-HT, henholdsvis gennem deres transportsystemer12,13,14,15,16,17 . Således er en ordentlig mekanistisk forståelse af monoaminfrigivelsesdynamik afgørende for at udvikle specifikke og målrettede farmakokterapier.
En bred vifte af teknikker er blevet anvendt til at studere monoamin frigivelse såsom Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo mikrodialyse13, imaging19, præincubation med radiolabeled monoaminer20, optogenetik, og for nylig, genetisk kodede fluorescerende sensorer og fotometri21,22 . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikker, der anvendes til at studere monoamin frigivelse. FSCV bruges til at studere den stimulerede eksocytotiske frigivelse af primært DA i akutte hjerneskiver og in vivo23. Fordi FSCV bruger elektroder til at stimulere eller fremkalde frigivelse, den primære kilde til neurotransmitter frigivelse er Ca2 +-afhængige køretøj frigivelse18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombineret med HPLC måler ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer ved hjælp af en sonde placeret i et hjerneområde af interesse13,32. Svarende til FSCV, en stor begrænsning for in vivo mikrodialyse er vanskeligheden ved at bestemme kilden til neurotransmitter frigivelse: Ca2 + afhængige køretøjsudløsning eller transporter afhængig. Bemærkelsesværdigt, begge metoder giver mulighed for direkte måling af monoamin frigivelse. Gennem den seneste udvikling af optogenetik, forskning viser påvisning af 5-HT og DA frigivelse i en kort tidshorisont med udsøgt celle-type specificitet21,22. Men, disse strategier kræver komplekse og dyre teknikker og udstyr, og indirekte måle monoamin frigivelse, specifikt gennem monoamin bindende for receptorer. Desuden bruges radiomærkede monoaminer også til at studere monoamindynamik. Radiomærkede monoaminer kan forudindlæses i forskellige modelsystemer såsom heterologe celler, der overekspresserer hver monoamintransporter20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære neuroner20, synaptoomer33,39,41, 42, og akut hjerne skiver43,44. Men, radioaktivitet udgør potentiel skade for eksperimentatoren, og tritium-mærket analytter kan ikke trofast generobre endogene monoamin dynamik45,46. Superfusionssystemer kombineret med offlinedetekteringsmetoder som HPLC-ECD har gjort det muligt at påektionere monoaminer fra flere vævskilder. Her giver denne protokol som en optimeret og billig, enkel og præcis metode ved hjælp af akutte hjerneskiver til direkte at måle endogene basal og stimuleret monoaminfrigivelse.
Akutte hjerneskive giver mulighed for at teste mekanistiske hypoteser, primært når de bevarer in vivo anatomiske mikromiljø, og opretholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I nogle få undersøgelser er akutte hjerneskiver eller hakket hjernevæv blevet brugt sammen med en superfusionsteknik ved hjælp af KCl til at stimulere Ca2+ medieret frigivelse53,54,55,56. Superfusion systemer har været afgørende for at fremme feltets forståelse af neurotransmitter frigivelse mekanismer, herunder monoaminer. Disse systemer er imidlertid relativt dyre, og antallet af kamre til rådighed til vævsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er den metode, der præsenteres her, billig, tillader måling af 48 vævsprøver og kan raffineres til at bruge op til 96 vævsprøver. Hver brønd i 48-brøndspladen indeholder vævsholdere, der bruger filtre til at adskille det frigivne produkt fra vævet, og frigivne monoaminer indsamles og analyseres derefter af HPLC-ECD. Vigtigere er det, at denne metode giver mulighed for samtidig måling af 5-HT, DA og NE-frigivelse fra forskellige hjerneområder som den præfrontale cortex, hippocampus og dorsale striatum efter behandling med farmakologiske midler, der modulerer monoaminfrigivelse. Således kan forsøgspersonen besvare flere spørgsmål ved hjælp af et billigt multi-brønd-system, der øger antallet af testede prøver og dermed reducerer antallet af anvendte dyr.
Monoamin frigivelse målinger er blevet udført i årevis i en række systemer såsom heterologe celler, neuronale kulturer, hjernesynaptosomes, ex vivo akutte hjerne skiver, og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68</…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud Fondecyt Initiation Fund N 11191049 til J.A.P. og NIH tilskud DA038598 til G.E.T.
48 Well plate | NA | NA | Assay |
Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
Clarity Software | Anetc | ||
Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay – 6 to fit in 48 well plate |
MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |