En pladebaseret analyse til måling af endogen monoaminfrigivelse i akutte hjerneskiver

Summary

Denne metode introducerer en simpel teknik til påvisning af endogene monoamin frigivelse ved hjælp af akutte hjerne skiver. Opsætningen bruger en 48-brønd plade, der indeholder en vævsholder til monoamin frigivelse. Frigivet monoamin analyseres af HPLC kombineret med elektrokemisk detektion. Derudover, denne teknik giver en screening metode til opdagelse af lægemidler.

Abstract

Monoamin neurotransmittere er forbundet med mange neurologiske og psykiatriske lidelser. Dyremodeller af sådanne forhold har vist ændringer i monoamin neurotransmitter frigivelse og optagelse dynamik. Teknisk komplekse metoder såsom elektrofysiologi, Hurtig ScanningCyclic Voltammetry (FSCV), billeddannelse, in vivo mikrodialyse, optogenetik, eller brug af radioaktivitet er påkrævet for at studere monoamin funktion. Metoden præsenteres her er en optimeret to-trins tilgang til påvisning af monoamin frigivelse i akutte hjerne skiver ved hjælp af en 48-brønd plade, der indeholder vævsholdere til undersøgelse af monoamin frigivelse, og højtydende flydende kromatografi kombineret med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) til monoamin frigivelse måling. Kort sagt blev rottehjerneafsnit, der indeholder områder af interesse, herunder præfrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum opnået ved hjælp af en vævsudsnitsbehandler eller vibratom. Disse interesseområder blev dissekeret fra hele hjernen og inkuberet i en iltet fysiologisk buffer. Levedygtigheden blev undersøgt i løbet af forsøgstiden ved 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akut dissekerede hjerneområder blev inkuberet under forskellige lægemiddelforhold, der vides at fremkalde monoaminfrigivelse gennem transportøren (amfetamin) eller gennem aktivering af eksocytotisk køretøjsfrigivelse (KCl). Efter inkubation blev de frigivne produkter i supernatanten indsamlet og analyseret gennem et HPLC-ECD-system. Her, basal monoamin frigivelse detekteres af HPLC fra akutte hjerne skiver. Disse data understøtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater, der viser, at AMPH og KCl fremkalder monoaminfrigivelse. Denne metode er især nyttig til at studere mekanismer forbundet med monoamin transporter-afhængige frigivelse og giver mulighed for at screene forbindelser, der påvirker monoamin frigivelse i en hurtig og billig måde.

Introduction

En overflod af neurologiske og psykiatriske sygdomme er forbundet med dysregulering eller utilstrækkelig vedligeholdelse af monoamin neurotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homøostase1,2,3. Disse betingelser omfatter, men er ikke begrænset til, ^{depression1,2}, skizofreni2, ^angst2, ^{afhængighed4}, overgangsalderen5,6,7, ^pain8, og Parkinsons ^sygdom3. For eksempel har flere rottemodeller af overgangsalderen vist, at dysregulering eller reduktion af monoaminer inden for hippocampus, præfrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depression og kognitiv tilbagegang, som ses hos kvinder, der oplever overgangsalderen. Dysreguleringen af monoaminer i disse modeller er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af HPLC-ECD, selv om undersøgelserne ikke diskriminerede mellem målt neurotransmitterindhold versus neurotransmitter ^release5,6,7. Monoaminer er klassisk frigives i ekstracellulære rum gennem ^{Ca2 +}-afhængige køretøj ^frigivelse9, og genbruges tilbage gennem deres respektive plasmamembran re-optagelse system (dopamin transporter, DAT; serotonin transporter, SERT; noradrenalin transporter, NET)^10,11. Omvendt tyder data på, at disse transportører er i stand til at frigive eller efflux monoaminer, da stoffer af misbrug såsom amfetamin (AMPH) og 3,4-Methylenedioxymethamfetamin (MDMA) er kendt for at frigive DA og 5-HT, henholdsvis gennem deres transportsystemer12,13,14,15,16,17 . Således er en ordentlig mekanistisk forståelse af monoaminfrigivelsesdynamik afgørende for at udvikle specifikke og målrettede farmakokterapier.

En bred vifte af teknikker er blevet anvendt til at studere monoamin frigivelse såsom Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)¹⁸, in vivo ^{mikrodialyse13}, ^imaging19, præincubation med radiolabeled monoaminer20, optogenetik, og for nylig, genetisk kodede fluorescerende sensorer og ^{fotometri21,22} . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikker, der anvendes til at studere monoamin frigivelse. FSCV bruges til at studere den stimulerede eksocytotiske frigivelse af primært DA i akutte hjerneskiver og in ^vivo23. Fordi FSCV bruger elektroder til at stimulere eller fremkalde frigivelse, den primære kilde til neurotransmitter frigivelse er ^{Ca2 +}-afhængige køretøj frigivelse18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombineret med HPLC måler ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer ved hjælp af en sonde placeret i et hjerneområde af ^{interesse13,32}. Svarende til FSCV, en stor begrænsning for in vivo mikrodialyse er vanskeligheden ved at bestemme kilden til neurotransmitter frigivelse: ^{Ca2 +} afhængige køretøjsudløsning eller transporter afhængig. Bemærkelsesværdigt, begge metoder giver mulighed for direkte måling af monoamin frigivelse. Gennem den seneste udvikling af optogenetik, forskning viser påvisning af 5-HT og DA frigivelse i en kort tidshorisont med udsøgt celle-type ^{specificitet21,22}. Men, disse strategier kræver komplekse og dyre teknikker og udstyr, og indirekte måle monoamin frigivelse, specifikt gennem monoamin bindende for receptorer. Desuden bruges radiomærkede monoaminer også til at studere monoamindynamik. Radiomærkede monoaminer kan forudindlæses i forskellige modelsystemer såsom heterologe celler, der overekspresserer hver monoamintransporter20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære ^neuroner20, synaptoomer33,39,41^{, 42}, og akut hjerne ^skiver43,44. Men, radioaktivitet udgør potentiel skade for eksperimentatoren, og tritium-mærket analytter kan ikke trofast generobre endogene monoamin ^dynamik45,46. Superfusionssystemer kombineret med offlinedetekteringsmetoder som HPLC-ECD har gjort det muligt at påektionere monoaminer fra flere vævskilder. Her giver denne protokol som en optimeret og billig, enkel og præcis metode ved hjælp af akutte hjerneskiver til direkte at måle endogene basal og stimuleret monoaminfrigivelse.

Akutte hjerneskive giver mulighed for at teste mekanistiske hypoteser, primært når de bevarer in vivo anatomiske mikromiljø, og opretholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I nogle få undersøgelser er akutte hjerneskiver eller hakket hjernevæv blevet brugt sammen med en superfusionsteknik ved hjælp af KCl til at stimulere ^Ca2+ medieret frigivelse53,54,55,56. Superfusion systemer har været afgørende for at fremme feltets forståelse af neurotransmitter frigivelse mekanismer, herunder monoaminer. Disse systemer er imidlertid relativt dyre, og antallet af kamre til rådighed til vævsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er den metode, der præsenteres her, billig, tillader måling af 48 vævsprøver og kan raffineres til at bruge op til 96 vævsprøver. Hver brønd i 48-brøndspladen indeholder vævsholdere, der bruger filtre til at adskille det frigivne produkt fra vævet, og frigivne monoaminer indsamles og analyseres derefter af HPLC-ECD. Vigtigere er det, at denne metode giver mulighed for samtidig måling af 5-HT, DA og NE-frigivelse fra forskellige hjerneområder som den præfrontale cortex, hippocampus og dorsale striatum efter behandling med farmakologiske midler, der modulerer monoaminfrigivelse. Således kan forsøgspersonen besvare flere spørgsmål ved hjælp af et billigt multi-brønd-system, der øger antallet af testede prøver og dermed reducerer antallet af anvendte dyr.

Protocol

Alle forsøg, herunder håndtering af dyr og vævsindsamling, blev udført i overensstemmelse med University of Florida og City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) efter den godkendte protokol 201508873 (UF) og 1071 (CCNY). For reagenser og buffer henvises til den supplerende fil. 1. Forbered akutte rotte hjerne skiver BEMÆRK: I dette forsøg blev der anvendt voksne hanrotter (250-350 g). Denne opsætning er imidle…

Representative Results

Denne teknik beskriver brugen af hjerneskiver til at måle frigivelsen af endogene monoaminer ved hjælp af HPLC med elektrokemisk detektion baseret i en 48-brønds plade med en indvendig vævsholder. Eksperimentel opsætning er afbildet i figur 1 og figur 2. For at sikre vævs levedygtighed ved forsøgets afslutning blev der i første omgang udført en MTT-analyse (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Efte…

Discussion

Monoamin frigivelse målinger er blevet udført i årevis i en række systemer såsom heterologe celler, neuronale kulturer, hjernesynaptosomes, ex vivo akutte hjerne skiver, og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68^</…

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer