Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës

Summary

Cette méthode introduit une technique simple pour la détection de la libération endogène de monoamine à l’aide de tranches cérébrales aiguës. La configuration utilise une plaque de 48 puits contenant un support de tissu pour la libération de monoamine. La monoamine libérée est analysée par CLHP couplée à une détection électrochimique. De plus, cette technique fournit une méthode de dépistage pour la découverte de médicaments.

Abstract

Les neurotransmetteurs monoamines sont associés à de nombreuses affections neurologiques et psychiatriques. Des modèles animaux de telles conditions ont montré des altérations de la libération de neurotransmetteurs monoamines et de la dynamique d’absorption. Des méthodes techniquement complexes telles que l’électrophysiologie, la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV), l’imagerie, la microdialyse in vivo, l’optogénétique ou l’utilisation de la radioactivité sont nécessaires pour étudier la fonction de la monoamine. La méthode présentée ici est une approche optimisée en deux étapes pour détecter la libération de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës à l’aide d’une plaque de 48 puits contenant des supports de tissu pour examiner la libération de monoamine, et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection électrochimique (HPLC-ECD) pour la mesure de la libération de monoamine. En bref, des coupes cérébrales de rats contenant des régions d’intérêt, y compris le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal, ont été obtenues à l’aide d’un slicer tissulaire ou d’un vibratome. Ces régions d’intérêt ont été disséquées de tout le cerveau et incubées dans un tampon physiologique oxygéné. La viabilité a été examinée tout au long de la période expérimentale, par un essai de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les régions cérébrales disséquées de manière aiguë ont été incubées dans diverses conditions médicamenteuses connues pour induire la libération de monoamine par le transporteur (amphétamine) ou par l’activation de la libération vésiculeuse exocytotique (KCl). Après l’incubation, les produits libérés dans le surnageant ont été collectés et analysés à l’aide d’un système HPLC-ECD. Ici, la libération de monoamine basale est détectée par HPLC à partir de tranches cérébrales aiguës. Ces données corroborent les résultats in vivo et in vitro antérieurs montrant que l’AMPH et le KCl induisent la libération de monoamines. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les mécanismes associés à la libération dépendante du transporteur de monoamine et offre la possibilité de filtrer les composés affectant la libération de monoamine de manière rapide et peu coûteuse.

Introduction

Une pléthore de maladies neurologiques et psychiatriques sont associées à un dérèglement ou à un entretien insuffisant du neurotransmetteur monoamine (dopamine [DA], sérotonine [5-HT], noradrénaline [NE]) homéostasie1,2,3. Ces conditions comprennent, sans toutefois s’y limiter, la ^{dépression1,2}, la ^{schizophrénie2}, l’anxiété2, la ^dépendance4, la ménopause5,6,7, la ^douleur8 et la maladie de<....

Protocol

Toutes les expériences, y compris la manipulation des animaux et la collecte de tissus, ont été menées conformément à l’Université de Floride et au City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), conformément aux protocoles approuvés 201508873 (UF) et 1071 (CCNY). Pour les réactifs et la mémoire tampon, reportez-vous au fichier supplémentaire.

1. Préparez des tranches de cerveau de rat aiguës

REMARQUE: Dans cette expérience, des rats mâles adultes (250-350 g) ont été utilisés. Cependant, cette configuration est fonctionnelle pour différents points de développement, les....

Results

Cette technique décrit l’utilisation de tranches cérébrales pour mesurer la libération de monoamines endogènes à l’aide de la CLHP avec détection électrochimique basée sur une plaque de 48 puits avec un support de tissu interne. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1 et à la figure 2. Initialement, pour assurer la viabilité des tissus à la fin de l’expérimentation, un essai MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,.......

Discussion

Des mesures de libération de monoamine ont été effectuées pendant des années dans un certain nombre de systèmes tels que les cellules hétérologues, les cultures neuronales, les synaptosomes cérébraux, les tranches cérébrales aiguës ex vivo et les animaux entiers13,20,41,42,58,64,65,66,67,68

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 Plaque de puits	NA	NA	Dosage
Acétonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Phase mobile
Chlorure de calcium Ahydre	Sigma Aldrich	C1016	Liquide céphalo-rachidien artificiel modifié OU Tampon d’efflux
Clarté Logiciel	Anetc
Acide citrique	Sigma Aldrich		Phase mobile
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Tampon de dissection
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich
Mobile Phase GraphPad Software Graphpad	Software, Inc		Analyse statistique
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Tampon de lyse
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Tampon de lyse
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, Système LC-EC
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
Acide L-asrobique	Sigma Aldrich	A5960	Tampon de dissection
Sulfate de magnésium	Sigma	7487-88-9	KH Tampon
Microcentrifugeuse Unités de filtre UltraFree	Millipore	C7554	Essai - 6 pour s’adapter à une plaque à 48 puits
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT
Essai Nanosep	VWR	29300-606	Essai ; dosage des protéines
Acide octanesulfonique	Sigma Aldrich	V800010	phase mobile
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Liquide céphalo-rachidien artificiel modifié OR Tampon
d’efflux Acide phosphorique	Sigma Aldrich		Phase mobile
Chlorure de potassium	Sigma	12636	KH Tampon
potassium monobasique	Sigma	Tampon 1001655559	KH
Tampon Précis VF-21-0Z	Compresstome	Précis
Inhibiteur de Protéase Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Tampon de lyse.
Bicarbonate	de sodium Sigma	S5761	Tampon de dissection
Bicarbonate de sodium	Sigma Aldrich	S5761	Tampon de dissection
Chlorure	de sodium Sigma	S3014	KH Tampon
Dodécylsulfate de sodium	Sigma Aldrich L3771 Tampon de		lyse
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Tampon de dosage / lyse