En platebasert analyse for måling av endogen monoaminfrigjøring i akutte hjerneskiver

Summary

Denne metoden introduserer en enkel teknikk for påvisning av endogen monoaminfrigjøring ved hjelp av akutte hjerneskiver. Oppsettet bruker en 48-brønns plate som inneholder en vevsholder for monoaminfrigjøring. Frigjort monoamin analyseres av HPLC kombinert med elektrokjemisk deteksjon. I tillegg gir denne teknikken en screeningmetode for narkotikaoppdagelse.

Abstract

Monoamin nevrotransmittere er forbundet med mange nevrologiske og psykiatriske plager. Dyremodeller av slike forhold har vist endringer i monoamin nevrotransmitter frigjøring og opptaksdynamikk. Teknisk komplekse metoder som elektrofysiologi, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), avbildning, in vivo mikrodialyse, optogenetikk eller bruk av radioaktivitet er nødvendig for å studere monoaminfunksjon. Metoden som presenteres her er en optimalisert to-trinns tilnærming for å oppdage monoaminfrigjøring i akutte hjerneskiver ved hjelp av en 48-brønns plate som inneholder vevsholdere for å undersøke monoaminfrigjøring, og høyytelses væskekromatografi kombinert med elektrokjemisk deteksjon (HPLC-ECD) for monoaminfrigjøringsmåling. Kort sagt ble rottehjerneseseksjoner som inneholder interesseregioner, inkludert prefrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum oppnådd ved hjelp av en vevsskive eller vibratom. Disse interesseområdene ble dissekert fra hele hjernen og inkubert i en oksygenert fysiologisk buffer. Levedyktighet ble undersøkt gjennom hele det eksperimentelle tidsforløpet, med 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akutt dissekerte hjerneregionene ble inkubert under varierende narkotikatilstander som er kjent for å indusere monoaminfrigjøring gjennom transportøren (amfetamin) eller gjennom aktivering av eksocytotisk vesikulær frigjøring (KCl). Etter inkubasjon ble de utgitte produktene i supernatanten samlet og analysert gjennom et HPLC-ECD-system. Her oppdages basal monoaminfrigjøring av HPLC fra akutte hjerneskiver. Disse dataene støtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater som viser at AMPH og KCl induserer monoaminfrigjøring. Denne metoden er spesielt nyttig for å studere mekanismer forbundet med monoamintransportøravhengig frigjøring og gir en mulighet til å screene forbindelser som påvirker monoaminfrigjøring på en rask og rimelig måte.

Introduction

En mengde nevrologiske og psykiatriske sykdommer er forbundet med dysregulering eller utilstrekkelig vedlikehold av monoamin nevrotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homeostase1,2,3. Disse forholdene inkluderer, men er ikke begrenset til, ^depresjon1,2, schizofreni2, ^angst2, ^avhengighet4, overgangsalder5,6,7, ^smerte8 og Parkinsons ^sykdom3. For eksempel har flere rottemodeller av overgangsalderen vist at dysregulering eller reduksjon av monoaminer i hippocampus, prefrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depresjon og kognitiv nedgang, som ses hos kvinner som opplever overgangsalderen. Dysreguleringen av monoaminer i disse modellene har blitt grundig undersøkt ved hjelp av HPLC-ECD, selv om studiene ikke diskriminerte mellom målt nevrotransmitterinnhold kontra nevrotransmitterutløsning5,6,7. Monoaminer slippes klassisk ut i det ekstracellulære rommet gjennom ^{Ca2 +}-avhengig vesikulær ^frigjøring9, og resirkuleres tilbake gjennom deres respektive plasmamembranreopptakssystem (dopamintransportør, DAT; serotonintransportør, SERT; noradrenalintransportør, NET)^10,11. På den annen side tyder data på at disse transportørene er i stand til å frigjøre eller efluksmonaminer, siden rusmidler som amfetamin (AMPH) og 3,4-Metylendioxymethamfetamin (MDMA) er kjent for å frigjøre HENHOLDSVIS DA og 5-HT gjennom sine transportørsystemer12,13,14,15,16,17 . Dermed er en riktig mekanistisk forståelse av monoaminfrigjøringsdynamikk avgjørende for å utvikle spesifikke og målrettede farmakoterapier.

Et bredt spekter av teknikker har blitt brukt til å studere monoaminutgivelse som Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)¹⁸, in vivo microdialysis13, ^imaging19, preincubation med radiomerket monoaminer20, optogenetikk og mer nylig genetisk kodede fluorescerende sensorer og ^{fotometri21,22} . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikkene som brukes for å studere monoaminfrigjøring. FSCV brukes til å studere den stimulerte eksocytotiske frigjøringen av, først og fremst, DA i akutte hjerneskiver og in ^vivo23. Fordi FSCV bruker elektroder for å stimulere eller fremkalle frigjøring, er den primære kilden til nevrotransmitterutløsning ^{Ca2 +}-avhengig vesikulær frigjøring18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombinert med HPLC måler endringer i ekstracellulære nevrotransmitternivåer ved hjelp av en sonde plassert i et hjerneområde av ^{interesse13,32}. I likhet med FSCV er en stor begrensning for in vivo-mikrodialyse vanskeligheten med å bestemme kilden til nevrotransmitterfrigjøring: ^{Ca2 +} avhengig vesicular release eller transportøravhengig. Bemerkelsesverdig tillater begge metodene direkte måling av monoaminfrigjøring. Gjennom den nylige utviklingen av optogenetikk viser forskning deteksjon av 5-HT og DA-utgivelse på kort tid med utsøkt celletypespesifisitet21,22. Disse strategiene krever imidlertid komplekse og kostbare teknikker og utstyr, og måler indirekte monoaminfrigjøring, spesielt gjennom monoaminbinding til reseptorer. Videre brukes radiomerkede monoaminer også til å studere monoamindynamikk. Radiomerkede monoaminer kan forhåndslastes i ulike modellsystemer som heterologe celler som overekspresserer hver monoamintransportør20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære ^nevroner20, synaptosomer33,39,41^{, 42}, og akutte ^{hjerneskiver43,44}. Imidlertid utgjør radioaktivitet potensiell skade på eksperimentet, og de tritium-merkede analyttene kan ikke trofast rekapitulere endogen ^{monoamindynamikk45,46}. Superfusjonssystemer kombinert med off-line deteksjonsmetoder som HPLC-ECD har tillatt påvisning av monoaminer fra flere vevskilder. Her gir denne protokollen som en optimalisert og rimelig, enkel og presis metode ved hjelp av akutte hjerneskiver for å direkte måle endogen basal og stimulert monoaminfrigjøring.

Akutte hjerneskiver gjør det mulig å teste mekanistiske hypoteser, først og fremst når de bevarer in vivo anatomisk mikromiljø, og opprettholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I noen få studier har akutte hjerneskiver eller hakket hjernevev blitt brukt i forbindelse med en superfusjonsteknikk ved hjelp av KCl for å stimulere ^{Ca2 +} mediert release53,54,55,56. Superfusjonssystemer har vært avgjørende for å fremme feltets forståelse av nevrotransmitterutløsningsmekanismer, inkludert monoaminer. Imidlertid er disse systemene relativt dyre, og antall kamre tilgjengelig for vevsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er metoden som presenteres her billig, tillater måling av 48 vevsprøver, og kan raffineres til å bruke opptil 96 vevsprøver. Hver brønn i 48-brønnsplaten inneholder vevsholdere som bruker filtre for å skille det frigjorte produktet fra vevet, og frigjorte monoaminer samles deretter inn og analyseres av HPLC-ECD. Viktigst, denne metoden tillater samtidig måling av 5-HT, DA og NE-frigjøring fra forskjellige hjerneområder som prefrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum etter behandling med farmakologiske midler som modulerer monoaminfrigjøring. Dermed kan eksperimentet svare på flere spørsmål ved hjelp av et billig multi-brønnsystem som øker antall prøver som er testet og dermed reduserer antall dyr som brukes.

Protocol

Alle eksperimenter, inkludert dyrehåndtering og vevsinnsamling, ble utført i samsvar med University of Florida og City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), etter den godkjente protokollen 201508873 (UF) og 1071 (CCNY). For reagenser og buffer, se tilleggsfilen. 1. Forbered akutte rottehjerneskiver MERK: I dette eksperimentet ble voksne hannrotter (250-350 g) brukt. Dette oppsettet er imidlertid funksjonelt for for…

Representative Results

Denne teknikken beskriver bruken av hjerneskiver for å måle frigjøring av endogene monoaminer ved hjelp av HPLC med elektrokjemisk deteksjon basert i en 48-brønns plate med en indre vevsholder. Eksperimentelt oppsett er avbildet i figur 1 og figur 2. I utgangspunktet, for å sikre vev levedyktighet ved slutten av eksperimenteringen, ble en MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, en tetrazole) analyse …

Discussion

Monoaminfrigjøringsmålinger har blitt utført i årevis i en rekke systemer som heterologe celler, nevronkulturer, hjernesynaptosomer, ex vivo akutte hjerneskiver og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<sup c…

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer