Sarcomere تقصير متعدد القدرات خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية باستخدام الفلورسنت الموسومة بروتينات ساركومير.
Summary
يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص تقصير الساركومير باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات مع بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت.
Abstract
يمكن إنتاج خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات (PSC-CMs) من كل من الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات (ES/iPS). توفر هذه الخلايا مصادر واعدة لنمذجة أمراض القلب. لأمراض عضلة القلب، وتقصير ساركومير هي واحدة من التقييمات الفسيولوجية القياسية التي تستخدم مع خلايا القلب الكبار لفحص الأنماط الظاهرية مرضهم. ومع ذلك، فإن الأساليب المتاحة ليست مناسبة لتقييم انكماش PSC-CMs، لأن هذه الخلايا لديها ساركوميرات متخلفة غير مرئية تحت المجهر التباين المرحلي. ولمعالجة هذه المسألة وإجراء تقصير الساركومير باستخدام PSC-CMs، استخدمت بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت والتصوير الحي الفلوري. رقيقة Z-خطوط وخط M يقيمون في كلا الطرفين ووسط ساركومير، على التوالي. تم وضع علامات على بروتينات Z-line — α-Actinin (ACTN2) وTelethonin (TCAP) وبروتين LIM المرتبط بال أكتين (PDLIM3) – وبروتين واحد من خط M – Myomesin-2 (Myom2) – ببروتينات فلورية. يمكن التعبير عن هذه البروتينات الموسومة من الأليل الذاتية كطرق أو من الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs). هنا، نقدم طرق للتمييز بين الماوس والخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لخلايا القلب، لإنتاج AAVs، وإجراء وتحليل التصوير الحي. كما نقوم بوصف طرق إنتاج طوابع البوليديمثيلسيلوكسيان (PDMS) لثقافة منقوشة من PSC-CMs ، مما يسهل تحليل تقصير الساركومير مع البروتينات الموسومة بالفلورسنت. لتقييم تقصير الساركومير، تم تسجيل صور الفاصل الزمني للخلايا النابضة بمعدل إطار مرتفع (50-100 إطار في الثانية) تحت التحفيز الكهربائي (0.5-1 هرتز). لتحليل طول الساركومير على مدار انكماش الخلية ، تعرضت الصور المسجلة الفاصل الزمني لSarcOptiM ، وهو مكون إضافي ل ImageJ / فيجي. توفر استراتيجيتنا منصة بسيطة للتحقيق في الأنماط الظاهرية لأمراض القلب في PSC-CMs.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم1 واعتلال عضلة القلب يمثل السبب الثالث للوفيات المرتبطة بالقلب2. اعتلال عضلة القلب هو مجموعة جماعية من الأمراض التي تؤثر على عضلات القلب. فتحت التطورات الأخيرة للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) والتمايز الموجه لخلايا iPS نحو خلايا القلب (PSC-CMs) الباب لدراسة خلايا القلب مع جينوم المريض كنموذج في المختبر لاعتلال عضلة القلب. ويمكن استخدام هذه الخلايا لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب، لتوضيح آلياتها الجزيئية، واختبار المرشحين العلاجية المختلفة3. هناك كمية هائلة من الاهتمام، وبالتالي، تم إنشاء خلايا iPS المشتقة من المريض (على سبيل المثال، اعتلال عضلة القلب الإفراطي [HCM]4،5، اعتلال عضلة القلب البطيني الأيمن غير المهيء بالقلب [ARVC]6، اعتلال عضلة القلب المتوسع [DCM]7، وأمراض القلب الميتوكوندريا ذات الصلة8،9). لأن واحدة من خصائص اعتلال عضلة القلب هو الخلل الوظيفي وتعطيل ساركومير، وهناك حاجة إلى أداة صالحة أن يقيس بشكل موحد وظيفة ساركومير.
تقصير ساركومير هو الأسلوب الأكثر استخداما لتقييم وظيفة الساركومير وانقباض خلايا القلب الكبار المستمدة من النماذج الحيوانية والبشر. لتنفيذ تقصير الساركومير، مطلوب ساركومير متطورة التي هي مرئية تحت مرحلة التباين. ومع ذلك، PSC-CMs مثقف في عرض المختبر ساركومير المتخلفة وغير منظمة، وبالتالي، غير قادرين على استخدامها لقياس ساركومير تقصير10بشكل صحيح . هذه الصعوبة في تقييم بشكل صحيح انقباض PSC-CMs يعوق استخدامها كمنصة لتقييم وظائف القلب في المختبر. لتقييم انكماش PSC-CMs بشكل غير مباشر ، تم استخدام مجهر القوة الذرية ، وصفائف البريد الدقيق ، والفحص المجهري لقوة الجر ، وقياسات المعاوقة لقياس آثار الحركة التي تمارسها هذه الخلايا على محيطها11،12،13. يمكن استخدام تسجيلات تصوير الفيديو المجهرية الأكثر تطورا والأقل غزوا للحركة الخلوية الفعلية (على سبيل المثال ، SI8000 من SONY) لتقييم قابليتها للانقباض بدلا من ذلك ، ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تقيس حركة الساركومير مباشرة أو قوة توليد الحركية14.
لقياس حركة الساركومير مباشرة في PSC-CMs ، تظهر نهج جديدة ، مثل وضع علامات الفلورسنت على بروتين الساركومير. على سبيل المثال، يستخدم Lifeact لتسمية أكتين خيوط (F-أكتين) لقياس حركة ساركومير15،16. خلايا iPS المعدلة وراثيا هي خيار آخر لوضع علامات على بروتينات الساركومير (على سبيل المثال، α-أكتينين [ACTN2] وميوميسين-2 [MYOM2]) بواسطة البروتين الفلوري17،18،19.
في هذه الورقة، ونحن نصف كيفية إجراء التصوير الفاصل الزمني لقياس تقصير الساركومير باستخدام Myom2-TagRFP (الماوس الجذعية الجنينية [ES] الخلايا) وACTN2-mCherry (خلايا iPS الإنسان). كما نظهر أن الثقافة المنقوشة تسهل محاذاة الساركومير. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بوصف طريقة بديلة لوضع العلامات على الساركومير، باستخدام الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs)، والتي يمكن تطبيقها على نطاق واسع على خلايا iPS المشتقة من المريض.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMs لديها إمكانات كبيرة لاستخدامها كمنصة في المختبر لنموذج أمراض القلب واختبار آثار الأدوية. ومع ذلك، يجب أولا وضع طريقة دقيقة وموحدة لتقييم وظائف نظام PSC-CMs. معظم الاختبارات الوظيفية تعمل مع PSC-CMs، على سبيل المثال، الكهربية، والكالسيوم عابرة، والتمثيل الغذائي26،وكانت وا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف بجميع أعضاء المختبر في شعبة الطب التجديدي في جامعة جيتشي الطبية للمناقشة المفيدة والمساعدة التقنية. وقد دعمت هذه الدراسة المنح المقدمة من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي؛ JP18bm0704012 و JP20bm0804018)، والجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS؛ JP19KK0219)، وجمعية التداول اليابانية (منحة للبحوث الأساسية) إلى جامعة H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
