蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine,Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics,Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering,Chuo University
Summary
この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。
Abstract
多能性幹細胞由来心筋細胞(PSC-CM)は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞(ES/iPS)細胞の両方から生成することができる。これらの細胞は、心疾患のモデリングのための有望な情報源を提供する。心筋症のサルコメア短縮は、成人型心筋細胞と共に疾患の型を調べるために使用される標準的な生理学的評価の1つである。しかし、これらの細胞は位相対比顕微鏡では見えないサルコメアを未発達にしているので、利用可能な方法はPSC-CMの収縮性を評価するのに適切ではない。この問題に対処し、PSC-CMでサルコメア短縮を行うために、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質および蛍光ライブイメージングを使用した。細いZ線とM線は、それぞれ両端とサルコメアの中心に存在する。z-ラインタンパク質は、αアクチニン(ACTN2)、テレトニン(TCAP)、アクチン関連LIMタンパク質(PDLIM3)、および1つのM線タンパク質であるミオメシン-2(Myom2))を蛍光タンパク質でタグ付けしました。これらのタグ付きタンパク質は、内因性対立アレスからノックインまたはアデノ関連ウイルス(AAV)から発現することができる。ここでは、マウスとヒト多能性幹細胞を心筋細胞に分化し、AAVを産生し、ライブイメージングを行い、分析する方法を紹介します。また、PSC-CMのパターン培養用ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプの製造方法についても説明し、蛍光タグ付きタンパク質によるサルコメア短縮の解析を容易にします。サルコメアの短縮を評価するために、拍動細胞のタイムラプス画像を電気刺激(0.5〜1Hz)下で高フレームレート(毎秒50〜100フレーム)で記録した。細胞収縮の過程でサルコメアの長さを分析するために、記録されたタイムラプス画像はImageJ / FijiのプラグインであるSarcOptiMに施されました。我々の戦略は、PSC-CMにおける心疾患のフェノタイプを調査するための簡単なプラットフォームを提供する。
Introduction
心血管疾患は、世界的に死亡率の主な原因である1と心筋症は、心臓関連死の第三の原因を表す2.心筋症は、心臓の筋肉に影響を与える疾患の集合群です。近年のiPS細胞の誘導多能性幹細胞の開発と、iPS細胞の心筋細胞(PSC-CM)に向けた指向分化が開かれて、心筋症のインビトロモデルとして患者ゲノムを用いた心筋細胞を研究する扉が開かれています。これらの細胞は、心疾患の病態生理を理解し、その分子機構を解明し、異なる治療候補3を試験するために使用することができる。多大な関心があり、したがって、患者由来のiPS細胞が生成されている(例えば、肥大性心筋症[HCM]4、5、不整脈性右心室心筋症[ARVC]6、拡張型心筋症[DCM]7、およびミトコンドリア関連心筋症8、9)。心筋症の特徴の1つはサルコメアの機能不全と破壊であるため、サルコメア機能を均一に測定する有効なツールが必要です。
サルコメア短縮は、サルコメア機能および動物モデルおよびヒトに由来する成体心筋細胞の収縮性を評価するために最も広く使用されている技術である。サルコメア短縮を行うためには、位相コントラスト下で見えるよく発達したサルコメアが必要である。しかしながら、インビトロディスプレイ培養されたPSC-CMは、未発達で組織化されていないサルコメアを培養し、したがって、サルコメア短縮10を適切に測定するために使用することができない。PSC-CMの収縮性を適切に評価するこの難しさは、インビトロで心臓機能を評価するためのプラットフォームとしての使用を妨げる。PSC-CMの収縮性を間接的に評価するために、原子間力顕微鏡、マイクロポストアレイ、トラクションフォース顕微鏡、およびインピーダンス測定が、これらの細胞がそれらの周囲に及ぼす運動の影響を測定するために使用されてきた。実際の細胞運動のより洗練された、より侵襲性の低いビデオ顕微鏡記録(例えば、SONYからのSI8000)は、それらの収縮性を評価するために使用することができるが、しかし、この方法はサルコメア運動または力発生動態14を直接測定しない。
PSC-CMのサルコメア運動を直接測定するために、サルコメアタンパク質への蛍光タグ付けなどの新しいアプローチが出現しています。例えば、Lifeactは、サルコメア運動15,16を測定するために糸状アクチン(F-actin)にラベルを付けるために使用される。遺伝子組み換えiPS細胞は、サルコメアタンパク質(例えば、αアクチニン[ACTN2]およびミオメシン-2[MYOM2])を蛍光タンパク質17、18、19によってタグ付けするためのもう一つの選択肢である。
本論文では、Myom2-TagRFP(マウス胚性幹細胞[ES]細胞)およびACTN2-mCherry(ヒトiPS細胞)を用いてサルコメア短縮を測定するためのタイムラプスイメージングを行う方法について述べた。我々はまた、パターン化された文化がサルコメアのアライメントを促進することを示す。さらに、患者由来のiPS細胞に広く応用できるアデノ関連ウイルス(AAV)を用いたサルコメア標識の代替方法について述べています。
Protocol
1. マウス多能性幹細胞の分化 マウスES細胞のメンテナンス メンテナンス培地:50mLのウシ胎児血清(FBS)、L-アラニン-L-グルタミン5mL、非必須アミノ酸5mL(NEAA)、100mMナトリウムピルビン酸ナトリウム、55mM 2-メルカプトエタノールの909 μlを450 mLの最小必須培地(GMEM)に混合します。補充白血病阻害因子(LIF)、CHIR-99021、PD0325901を最終濃度1000 U/mL、1μM、3μMでそれぞれ補充します。0.22 μmフィ?…
Representative Results
ノックインPSC-CMレポーターラインを使用したサルコメア短縮測定。サルコメアラベルPSC-CMはサルコメア短縮を測定するために使用されました。ラインは内在性の場所からMyom2-RFPとACTN2-mCherryを表現します。TagRFPはMyom2に挿入され、M線に局地化するMタンパク質をコーディングし、mCherryはACTN2にノックインされ、αアクチニンをコーディングし、Z…
Discussion
PSC-CMは、心臓病をモデル化し、薬物の効果をテストするためのインビトロプラットフォームとして利用される大きな可能性を秘めています。ただし、PSC-CM 関数を評価する正確で統一された方法を最初に確立する必要があります。機能検査の大部分はPSC-CMで働き、例えば、電気生理学、カルシウム過渡性、および代謝26、および最初の患者由来のPSC-CM試験の1つは、長い…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jichi医科大学再生医療部門のラボメンバーの皆さん、有益な議論と技術支援を受けたい。本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の助成金により支援されました。日本学術振興会(JSPS;日本循環学会(基礎研究助成)をH.U.に
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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Citer Cet Article
Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).