Utilisation du système GAL4-UAS pour la génétique fonctionnelle chez Anopheles gambiae

Summary

Le système bipartite GAL4-UAS est un outil polyvalent pour la modification de l’expression des gènes de manière spatio-temporelle contrôlée qui permet une analyse génétique fonctionnelle chez Anopheles gambiae. Les procédures décrites pour l’utilisation de ce système sont une stratégie de clonage semi-standardisée, le sexage et le dépistage des pupes pour les marqueurs de protéines fluorescentes et la fixation des embryons.

Abstract

Le système bipartite GAL4-UAS est un outil polyvalent et puissant pour l’analyse génétique fonctionnelle. L’essence du système est de croiser des lignées transgéniques « pilotes » qui expriment le facteur de transcription de levure GAL4 d’une manière spécifique au tissu, avec des lignées transgéniques « répondeurs » portant une construction d’interférence gène / ARN candidate dont l’expression est contrôlée par des séquences d’activation en amont (UAS) qui se lient à GAL4. Dans la descendance qui s’ensuit, le gène ou la construction de silençage est donc exprimé d’une manière spatio-temporelle prescrite, ce qui permet de tester les phénotypes résultants et d’en déduire la fonction du gène. Le système binaire permet une flexibilité dans les approches expérimentales pour dépister les phénotypes générés par l’expression du transgène dans de multiples modèles spécifiques aux tissus, même si des coûts de condition physique élevés sont induits. Nous avons adapté ce système à Anopheles gambiae, le principal vecteur du paludisme en Afrique.

Dans cet article, nous fournissons certaines des procédures courantes utilisées lors de l’analyse GAL4-UAS. Nous décrivons les lignes An. gambiae GAL4-UAS déjà générées, ainsi que le clonage de nouvelles constructions de répondeurs pour la régulation à la hausse et l’ARNi. Nous spécifions un guide étape par étape pour le sexage des pupes de moustiques afin d’établir des croisements génétiques, qui comprend également le dépistage de la progéniture pour suivre l’héritage des marqueurs génétiques fluorescents qui marquent les insertions du conducteur et du répondeur. Nous présentons également un protocole pour le nettoyage des embryons d’An. gambiae afin d’étudier le développement embryonnaire. Enfin, nous introduisons des adaptations potentielles de la méthode pour générer des lignes pilotes par insertion CRISPR/Cas9 de GAL4 en aval des gènes cibles.

Introduction

Le système bipartite GAL4-UAS est le cheval de bataille de la caractérisation fonctionnelle des gènes de l’organisme modèle d’insecte Drosophila melanogaster1,2,3. Pour utiliser le système GAL4-UAS, des lignées pilotes transgéniques, exprimant le facteur de transcription de levure GAL4 sous contrôle d’une séquence régulatrice, sont croisées avec des lignes de répondeur portant un gène d’intérêt ou une construction d’interférence ARN (ARNi) contrôlée par une séquence d’activation en amont (UAS) reconnue par GAL4. La descendance de ce croisement exprime le transgène d’intérêt pour un schéma spatio-temporel dicté par le promoteur contrôlant l’expression GAL4 (Figure 1). Les phénotypes affichés par la descendance des croisements conducteur-répondeur peuvent être évalués pour élucider la fonction des gènes candidats. Bien que D. melanogaster ait été utilisé pour examiner les gènes d’autres organismes4,5,6,7, le système GAL4-UAS a maintenant été adapté pour être utilisé chez les insectes d’importance médicale et agricole afin de fournir une analyse directe des espèces d’intérêt ^{8,9,10,11,12,13,14}.

Chez le moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae, le système GAL4-UAS a d’abord été testé par co-transfection de lignée ^cellulaire9. Plusieurs constructions ont été testées pour l’efficacité dans différentes combinaisons par paires et ont constaté que 14 UAS répétés en tandem complétés par un petit intron artificiel (UAS-14i) présentaient la plus large gamme de potentiel d’activation lorsqu’ils étaient utilisés avec un panel de pilotes GAL4. Pour démontrer la fonctionnalité in vivo, ces constructions ont ensuite été utilisées pour créer deux lignées transgéniques distinctes d’An. gambiae par transformation ^PiggyBac8 : une ligne pilote portant GAL4 entraînée par un promoteur spécifique de l’intestin moyen, et une ligne répondeur contenant à la fois les gènes de la luciférase et de la protéine fluorescente jaune améliorée (eYFP) sous régulation des séquences UAS. L’activité de la luciférase spécifique à l’intestin et la fluorescence dans la progéniture ont indiqué que le système était efficace chez les anophèles. Depuis lors, des lignées conductrices ont été créées exprimant des transgènes dans d’autres tissus importants pour la capacité vectorielle et la résistance aux insecticides, y compris les œnocytes15 et les hémocytes16, et dans un schéma proche de l’omniprésence10. De nombreuses lignées d’UAS ont également été générées pour tester les gènes soupçonnés d’être impliqués dans le métabolisme et la résistance aux insecticides médiés par la séquestration, la synthèse des hydrocarbures cuticulaires et pour marquer par fluorescence différents types de cellules et de tissus (tableau 1). Pour les lignes répondeuses, l’intégration dirigée par site du transgène est maintenant réalisée par échange de cassettes de recombinaison catalysée ΦC31111111111 ^{pour fixer} le contexte génomique des gènes régulés par UAS. De cette façon, l’expression du transgène est normalisée en ce qui concerne l’emplacement d’insertion génomique, ce qui permet une comparaison plus précise des effets phénotypiques de différents gènes candidats.

Les lignes de répondeur créées à ce jour sont conçues pour exprimer le transgène à des niveaux élevés ou pour réduire l’expression des gènes par interférence ARN (ARNi). Habituellement, les clones d’ADNc sont fusionnés à la séquence UAS pour générer des plasmides d’expression appropriés, mais des séquences génomiques complètes sont également réalisables en supposant qu’elles ne sont pas trop grandes pour le clonage. Pour générer des constructions de silencieux, nous avons utilisé trois méthodes différentes pour obtenir des séquences inversées en tandem appropriées qui forment un ARNd en épingle à cheveux qui stimule l’ARNi. Ceux-ci ont inclus la PCR par fusion, la PCR asymétrique et la synthèse commerciale de constructions en épingle à cheveux. Chaque méthode a en commun l’inclusion d’une séquence d’introns entre les séquences inversées pour assurer la stabilité du clonage. Des plasmides répondeurs dans lesquels un gène d’intérêt/construction d’ARNi peut être inséré ont été ^{développés15}. Ces plasmides portent également les sites ΦC31 attB requis pour le RMCE (décrits dans l’article d’Adolfi accompagnant JoVE qui décrit en détail la technique RCME). Des protocoles couvrant les étapes importantes requises lors de la sélection de la séquence à insérer dans l’un de ces plasmides pour la surexpression sont inclus dans ce manuscrit. De plus, deux protocoles pour la création de construction en épingle à cheveux ARNi sont décrits et illustrés.

Lors de la création de nouvelles lignées, l’identification d’individus transgéniques rares est cruciale pour se reproduire afin d’établir et de maintenir des colonies transgéniques. Plus important encore, pour le système GAL4-UAS, il est nécessaire de distinguer les lignes d’intervention et de conducteur afin d’établir des croisements et d’identifier les descendants individuels porteurs des deux transgènes. Ceci est réalisé en utilisant différents gènes marqueurs sélectionnables dominants liés aux cassettes du conducteur et du répondeur. Le plus souvent, il s’agit de gènes marqueurs fluorescents qui peuvent être clairement distingués à l’aide de filtres optiques (par exemple, eYFP, eCFP, dsRed). Il est important que les marqueurs soient exprimés selon un schéma spatio-temporel connu et fiable, car cela facilite l’identification des anomalies et de la contamination. L’expression du gène marqueur fluorescent est régulièrement régulée par le promoteur synthétique 3xP3, qui provoque une expression spécifique des ganglions oculaires et ventraux à tous les stades du développement d’An. gambiae19. Les marqueurs fluorescents contrôlés par 3xP3 sont inclus dans tous les plasmides de transformation décrits dans cet article. Un protocole détaillant les méthodes courantes utilisées pour filtrer les lignes fluorescentes An. gambiae pupae GAL4-UAS est inclus ici.

L’un des éléments clés du système GAL4-UAS est la nécessité de traverser les lignes de conduite et d’intervention marquées différentiellement. Pour ce faire, les mâles et les femelles de chaque lignée doivent être séparés avant l’accouplement. Les adultes se distinguent facilement par la vue, cependant, pour établir des croisements génétiques, il est judicieux de séparer les sexes avant l’émergence de l’adulte pour s’assurer que l’accouplement n’a pas eu lieu. La différence de taille générale entre les pupes an. gambiae mâles et femelles est trop variable pour être une méthode efficace et fiable de détermination du ^sexe20. Au lieu de cela, des différences morphologiques claires dans les organes génitaux externes fournissent une base fiable pour le sexage chez An. gambiae. Dans cet article, nous décrivons une méthode fiable pour sexer les pupes d’An. gambiae afin de mettre en place des croisements appropriés.

Figure 1 – Représentation schématique du processus d’utilisation du système bipartite GAL4-UAS dans Anopheles gambiae. (A) Les principaux composants d’un exemple de vecteur (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) sont représentés, détaillant les sites de restriction disponibles (EcoRI, NheI, XhoI et NcoI) dans les multiples sites de clonage qui peuvent être utilisés pour insérer la construction en épingle à cheveux ou la séquence codante pour le gène d’intérêt. La structure de la ligne d’amarrage est également représentée. (B) L’étape de croisement est illustrée en indiquant l’utilisation d’hommes de la ligne de conduite (transportant le conducteur GAL4 par un promoteur d’intérêt et eCFP piloté par le promoteur 3xP3) et de femelles de la ligne de réponse (portant le gène d’intérêt ou la construction en épingle à cheveux contrôlée par un promoteur UAS et un marqueur eYFP contrôlé par le promoteur 3xP3). (C) Une représentation schématique de GAL4 conduisant l’expression du gène d’intérêt dans la descendance du croisement dans B et une liste de certains des phénotypes typiques qui sont évalués. Abréviations : Site de clonage multiple (MCS), échange de cassettes médié par la recombinase (RMCE), séquence d’activateur en amont (UAS), protéine fluorescente jaune améliorée (eYFP), protéine fluorescente cyan améliorée (eCFP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

C’est l’utilisation de croisements qui fournit la nature bipartite du système GAL4-UAS, qui présente des avantages distincts par rapport aux approches plus linéaires. Par exemple, beaucoup plus de combinaisons de lignées conductrices et répondeuses peuvent être évaluées que ce qui serait faisable si une nouvelle lignée transgénique devait être générée et maintenue pour chaque combinaison promoteur/gène. Plus important encore, il permet l’analyse de gènes qui produisent des phénotypes mortels ou stériles lorsque leur expression est perturbée et qui sont difficiles à créer / maintenir dans un système linéaire. De tels phénotypes mortels peuvent se manifester à tous les stades de développement, en fonction de la fonction du gène et de l’expression spatio-temporelle, mais sont le plus souvent observés au cours du développement embryonnaire. La visualisation du développement embryonnaire de moustique nécessite l’élimination du chorion opaque qui recouvre les œufs. En suivant les méthodes décrites dans Trpiš (1970)²¹ et Kaiser et al. (2014)²², nous décrivons les protocoles que nous utilisons pour fixer les embryons, tout en maintenant l’intégrité structurelle, et le blanchiment pour éliminer l’endochorion qui permet la visualisation et l’imagerie microscopiques.

Protocol

1. Conception et construction de constructions UAS Conception et assemblage de vecteurs pour l’expression de gènes candidats Déterminer la séquence à utiliser pour la régulation à la hausse des gènes candidats. Séquencer l’ADNc/ADNg de la souche d’intérêt et le comparer à la séquence publiée pour vérifier son identité et identifier les SNP potentiels et les sites de restriction pour le digest diagnostique. Assurez-vous que l’…

Representative Results

L’expression 3xP3 d’eYFP, dsRed et eCFP fournit une identification fiable et facilement reconnaissable des individus possédant les gènes marqueurs produisant l’expression dans les yeux et les ganglions ventraux des nymphes d’An. gambiae (Figure 3). La morphologie différentielle observée dans les organes génitaux externes mâles et femelles utilisés pour le sexage et un exemple de pupe non identifiable sont mis en évidence à la figure 4</…

Discussion

Comprendre la fonction des gènes des moustiques est essentiel pour développer de nouvelles approches pour contrôler les anophèles et avoir un impact sur la transmission du paludisme. Le système GAL4-UAS décrit est un système polyvalent et puissant pour l’analyse fonctionnelle des gènes candidats et, à ce jour, nous avons utilisé le système pour examiner la base génétique de la résistance aux ^{insecticides17} et de la production d’hydrocarbures ^{cuticulaire…}

Materials

100 x 15 mm plastic Petri dish	SLS	2175546	Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette	Gilson	F144059P
20/25 mL Universal Tubes	Starlab	E1412-3020	Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes	SLS	G612398	Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Acetic Acid	SLS	45726-1L-F	1 L
Cages	SLS	E6099	30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food	Amazon		Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L
Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	F8775
Mouth Aspirator	John Hock	612
Pond Salt	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L
Pupae Pots	Cater4you	SP8OZ	250 pots with lids
Small Plastic Buckets	Amazon		2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)
Sodium Hypochlorite	Fisher Scientific	S25552