Systematisk scoringsanalyse for tarmbetennelse i en murine dekstran natriumsulfatindusert kolittmodell
Summary
Systematisk skåring av tarmbetennelse ved hjelp av et gratis dataassistert system er et kraftig verktøy for kvantitativt å sammenligne histopatologiske endringer i kolittmodeller preget av tilstedeværelse av sår og inflammatoriske endringer. Histologisk kolitt score evaluering styrker kliniske observasjoner og letter datatolkning.
Abstract
Murine kolittmodeller er verktøy som er mye brukt i studier fokusert på å forstå patologien til inflammatoriske tarmsykdommer. Robuste standarder for objektiv og reproduserbar kvantifisering av alvorlighetsgraden av sykdommen gjenstår imidlertid å definere. De fleste kolittanalysemetoder er avhengige av begrenset histologisk skåring av små tarmsegmenter, noe som fører til delvise eller partiske analyser. Her kombinerer vi høyoppløselig bildeoppkjøp og langsgående analyse av hele tykktarmen for å kvantifisere tarmskade og sårdannelse i det dekstranske natriumsulfatet (DSS) indusert modell av murin kolitt. Denne protokollen muliggjør generering av objektive og reproduserbare resultater uten omfattende brukeropplæring. Her gir vi omfattende detaljer om prøvepreparering og bildeanalyse ved hjelp av eksempler på data fra DSS-indusert kolitt. Denne metoden kan lett tilpasses andre modeller av murin kolitt som har betydelig betennelse forbundet med slimhinneskade. Vi viser at brøkdelen av betent/skadet og erodert/sårslimhinne i forhold til den totale lengden på tykktarmen paralleller nøye kliniske funn som vekttap blant DSS-indusert sykdomsprogresjon. Denne histologiske protokollen gir et pålitelig tids- og kostnadseffektivt hjelpemiddel for å standardisere analyser av sykdomsaktivitet på en objektiv måte i DSS-kolitteksperimenter.
Introduction
Den gastrointestinale epitelbarrieren spiller en sentral rolle i å skille lysende antigener og patogener fra underliggende vevsrom1. Epitelskade og slimhinnesår sett i patologiske tilstander som inflammatorisk tarmsykdom (IBD), iskemi eller kirurgisk skade er forbundet med kliniske symptomer som inkluderer diaré, vekttap, blod i avføring og magesmerter. Som svar på skade migrerer epitelceller og sprer seg for å re-epitelialisere og reparere mucosal barrierefeil. Oppløsning av betennelse og restitusjon av mucosal integritet er avgjørende for å gjenopprette intestinal mucosal homeostase og funksjon2,3,4.
Ulike dyremodeller har blitt brukt til å studere de underliggende molekylære mekanismene som er forbundet med skaden på tarmepitelbarrieren. Veletablerte og lett anvendelige modeller av kjemisk indusert kolitt er mye brukt, spesielt i studier relatert til inflammatorisk skade som IBD. En vanlig, reproduserbar og pålitelig murin kolitt modell bruker dextran natriumsulfat (DSS) mediert kolonisyreskade og betennelse. Alvorlighetsgraden av sykdommen varierer avhengig av musestamme, dose DSS, lengde på DSS-administrasjon og molekylvekt av DSS5,6,7.
Intestinal slimhinneskade under DSS-kolitt evalueres vanligvis ved hjelp av Disease Activity Index (DAI), en sammensatt poengsum bestemt av vekttap, fekalt blodinnhold og avføringskonsistens. Fekalt blodinnhold kan være mikroskopisk (oppdaget ved hjelp av en avføring guaiac acid test) eller makroskopisk; fekal konsistens er klassifisert som hard, myk eller flytende (dvs. diaré)5,8. Skåring av disse kliniske parametrene kan være subjektiv og kan variere avhengig av brukerens erfaring og skjevhet, selv om dataene generelt gir pålitelig informasjon og dermed er mye brukt av IBD-forskere. Derimot er det ingen allment akseptert metode for histologisk evaluering av slimhinneskade. Vanligvis blir utvalgte områder av tykktarmen inspisert av en trent patolog og scoret basert på flere parametere som vanligvis inkluderer kryptskade og leukocyttinfiltrasjon9,10,11. Men fordi antallet undersøkte parametere og mengden vev som analyseres varierer betydelig mellom individuelle rapporter, er sammenlignbarheten til mange publiserte studier begrenset. For å redusere observatørbias og forbedre konkordansen mellom studiene, bør en ideell histologisk scoringsprotokoll: 1) inkludere hele tykktarmens lengde, da tarmmukosal betennelse oftest er variabel og hopp over lesjoner er vanlig, 2) begrense analysen til spesifikke viktige og lett fortolkelige parametere for å redusere subjektivitet, 3) legge til rette for rask, konsistent behandling av et stort antall prøver, og 4) bruke allment tilgjengelige og rimelige verktøy for datainnsamling, analyse og presentasjon.
Her beskriver vi en teknikk for å behandle hele tykktarmen eller lange segmenter av tynntarmen i en “swiss roll” -konfigurasjon sammen med bruk av et gratis dataassistert skåringssystem for å analysere tarmmukosal betennelse og skade på grunn av DSS-indusert kolitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt Histologiske Colitis Score-system utgjør et pålitelig verktøy for å kvantifisere vevsbetennelse og skade i tarmen. Denne tilnærmingen gir en forbedret forståelse av det histopatologiske tilstanden til hele orgelet uten skjevheten ved å velge små områder eller ufullstendige seksjoner. Blant de kritiske trinnene for å utføre denne protokollen er riktig forberedelse av sveitsiske ruller som tillater analyse av minst 90% av tykktarmens lengde; parallell orientering under parafininnbygging og seksjonering for…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra NIH-finansiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 og University of Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
