Модель сингенной ортотопической остеосаркомы Sprague Dawley Rat с ампутацией для контроля скорости метастазирования
Summary
Здесь описана сингенная ортотопическая имплантация с последующей процедурой ампутации остеосаркомы со спонтанным легочным метастазированием, которая может быть использована для доклинического исследования биологии метастазирования и разработки новых терапевтических средств.
Abstract
Самый последний прогресс в лечении остеосаркомы (ОС) произошел в 1980-х годах, когда было показано, что многоагентная химиотерапия улучшает общую выживаемость по сравнению с одной только хирургией. Для решения этой проблемы целью исследования является уточнение менее известной модели ОС у крыс с комплексным гистологическим, визуальным, биологическим, имплантационным и ампутационным хирургическим подходом, который продлевает выживание. Мы использовали иммунокомпетентную, беспородную модель Sprague-Dawley (SD), сингенную модель крысы с имплантированной клеточной линией ОС UMR106 (происходящей от SD-крысы) с ортотопическими имплантатами опухоли большеберцовой кости у 3-недельных самцов и самок крыс для моделирования педиатрической ОС. Мы обнаружили, что у крыс развиваются воспроизводимые первичные и метастатические опухоли легких, и что ампутации конечностей через 3 недели после имплантации значительно снижают частоту легочных метастазов и предотвращают неожиданные смерти. Гистологически первичные и метастатические ОС у крыс были очень похожи на ОС человека. Используя методы иммуногистохимии, исследование показывает, что ОС крыс инфильтрированы макрофагами и Т-клетками. Исследование экспрессии белка клеток ОС показывает, что эти опухоли экспрессируют киназы семейства ErbB. Поскольку эти киназы также высоко экспрессируются в большинстве ОС человека, эта модель крыс может быть использована для тестирования ингибиторов пути ErbB для терапии.
Introduction
Остеосаркома (ОС) является наиболее распространенной первичной опухолью кости у детей, подростков и молодых людей. Самый последний прогресс в лечении ОС произошел в 1980-х годах, когда было показано, что многоагентная химиотерапия улучшает общую выживаемость по сравнению с одной только хирургией1. ОС развивается во время быстрого роста костей, обычно происходящего в длинных трубчатых костях, таких как бедренная кость, большеберцовая кость и плечевая кость. Они характеризуются остеолитическим, остеобластным или смешанным внешним видом с заметной периостальной реакцией2. Химиотерапия и хирургическая резекция могут улучшить исход для пациентов с 5-летней выживаемостью для 65% пациентов2,3. К сожалению, пациенты с ОС высокой степени с метастатическим заболеванием имеют 20% выживаемость. ОС вторгается регионально и метастазирует в основном в легкие или другие кости и более распространен у мужчин. Наиболее насущной потребностью для этих молодых пациентов является новая терапия, которая предотвращает и устраняет жизнеспособность отдаленных метастазов.
Рассмотрены доклинические модели ОС4,5,6,7 и разработано несколько доступных иммунокомпетентных моделей с использованием ампутации ортотопической ОС. В 2000 году была разработана важная модель с использованием мышей BALB/c с ортотопической сингенной ОС и ампутацией8. По сравнению с этой моделью мыши, модель крыс основана на генетически перерожденных и в 10 раз более крупных животных, что приводит к некоторым преимуществам. Крысиная модель UMR106 была разработана из 32P индуцированной ОС у крысы Sprague Dawley (SD), которая была выведена в клеточную линию9. В 2001 году ортотопическая имплантация UMR106-01 была впервые описана в имплантированные большеберцовые кости афимических мышей с быстрым, последовательным развитием первичной опухоли и рентгенологическими, гистологическими особенностями, общими с ОС у человека. Легочные метастазы развивались и зависели от ортотопического размещения UMR106 в костном микроокружении10. В 2009 году Yu et al.11 установили воспроизводимую ортотопическую модель ОС бедренной кости крысы с использованием клеток UMR106 у более крупных самцов SD-крыс. Успешные имплантации опухолей и частота метастазирования в легкие у крыс без ампутации были аналогичны данным, представленным здесь. В этом исследовании была выполнена дополнительная ампутация к модели с использованием молодых крыс, которая показала, что сроки первичного удаления опухоли имеют решающее значение для моделирования ОС, особенно связанных с метастатическим прогрессированием. Благодаря этому уточнению ампутация и визуализация in vivo улучшают эту модель для доклинических исследований для оценки новых лекарств для ОС.
Protocol
Representative Results
Discussion
У крыс с имплантатами ОС большеберцовой кости развиваются измеримые опухоли к 3 неделям после имплантации. Если конечности с опухолями ампутируют через 3 недели после имплантации, частота метастазирования в легкие значительно снижается. ОС являются как остеолитическими, так и остеобл?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование NIH через Национальный институт рака, грант # CA228582. Шун Исияма в настоящее время получает грант от Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189 (2014).
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Recherche en cancérologie. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
