Een syngeneïsch orthotopisch osteosarcoom Sprague Dawley Rat-model met amputatie om de metastasesnelheid te beheersen
Summary
Hier wordt een syngenetische orthotopische implantatie gevolgd door een amputatieprocedure van het osteosarcoom met spontane pulmonale metastase beschreven die kan worden gebruikt voor preklinisch onderzoek van metastasebiologie en ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Abstract
De meest recente vooruitgang in de behandeling van osteosarcoom (OS) vond plaats in de jaren 1980 toen multi-agent chemotherapie werd aangetoond dat het de algehele overleving verbeterde in vergelijking met chirurgie alleen. Om dit probleem aan te pakken, is het doel van de studie om een minder bekend model van OS bij ratten te verfijnen met een uitgebreide histologische, beeldvormings-, biologische, implantatie- en amputatiechirurgische benadering die de overleving verlengt. We gebruikten een immunocompetente, gefokte Sprague-Dawley (SD), syngenetisch ratmodel met geïmplanteerde UMR106 OS-cellijn (afkomstig van een SD-rat) met orthotopische tibiale tumorimplantaten in 3 weken oude mannelijke en vrouwelijke ratten om pediatrische OS te modelleren. We ontdekten dat ratten reproduceerbare primaire en gemetastaseerde longtumoren ontwikkelen en dat ledemaatamputaties 3 weken na implantatie de incidentie van pulmonale metastase aanzienlijk verminderen en onverwachte sterfgevallen voorkomen. Histologisch gezien leken de primaire en gemetastaseerde besturingssystemen bij ratten sterk op humane OS. Met behulp van immunohistochemische methoden toont de studie aan dat ratten OS zijn geïnfiltreerd met macrofagen en T-cellen. Een eiwitexpressie-onderzoek van OS-cellen onthult dat deze tumoren ErbB-familiekinasen tot expressie brengen. Omdat deze kinasen ook sterk tot expressie komen in de meeste menselijke besturingssystemen, kan dit rattenmodel worden gebruikt om ErbB-routeremmers te testen voor therapie.
Introduction
Osteosarcoom (OS) is de meest voorkomende primaire bottumor bij kinderen, adolescenten en jonge volwassenen. De meest recente vooruitgang in de behandeling van OS vond plaats in de jaren 1980 toen multi-agent chemotherapie de algehele overleving bleek te verbeteren in vergelijking met chirurgie alleen1. OS ontwikkelt zich tijdens snelle botgroei, meestal voorkomend in lange buisvormige botten zoals dijbeen, scheenbeen en opperarmbeen. Ze worden gekenmerkt door een osteolytisch, osteoblastisch of gemengd uiterlijk met opmerkelijke periostale reactie2. Chemotherapie en chirurgische resectie kunnen de uitkomst verbeteren voor patiënten met een 5-jaarsoverleving voor 65% van de patiënten2,3. Helaas hebben hooggradige OS-patiënten met gemetastaseerde ziekte een overleving van 20%. OS dringt regionaal binnen en metastaseert voornamelijk naar de longen of andere botten en komt vaker voor bij mannen. De meest dwingende behoefte voor deze jonge patiënten is een nieuwe therapie die de levensvatbaarheid van metastasen op afstand voorkomt en elimineert.
OS preklinische modellen zijn beoordeeld4,5,6,7 en er zijn weinig beschikbare immunocompetente modellen ontwikkeld met behulp van amputatie van orthotopisch OS. In 2000 werd een belangrijk model ontwikkeld met BALB/c muizen met orthotopisch syngeneïsch OS en amputatie8. Vergeleken met dit muismodel is het rattenmodel gebaseerd op genetisch gefokte en 10 keer grotere dieren, wat tot enkele voordelen leidt. Het rat UMR106-model werd ontwikkeld op basis van een 32P geïnduceerde OS in een Sprague Dawley (SD) rat, die werd afgeleid in een cellijn9. In 2001 werd orthotopische implantatie van UMR106-01 voor het eerst beschreven in geïmplanteerde tibia’s van athymische muizen met snelle, consistente primaire tumorontwikkeling en radiologische, histologische kenmerken die gemeen hebben met OS bij mensen. Pulmonale metastasen ontwikkelden en waren afhankelijk van orthotopische plaatsing van UMR106 in de botmicro-omgeving10. In 2009 hebben Yu et al.11 een reproduceerbaar orthotopisch femur OS-ratmodel vastgesteld met behulp van UMR106-cellen in grotere mannelijke SD-ratten. De succesvolle tumorimplantaties en longmetastasesnelheid bij ratten zonder amputatie waren vergelijkbaar met de hier gepresenteerde gegevens. In deze studie werd een toegevoegde amputatie aan het model uitgevoerd met behulp van jonge ratten, wat suggereerde dat de timing van primaire tumorverwijdering cruciaal is bij het modelleren van OS, vooral gerelateerd aan metastatische progressie. Met deze verfijning verbeteren amputatie en in vivo beeldvorming dit model voor preklinische studies voor de beoordeling van nieuwe geneesmiddelen voor OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ratten met OS tibiale implantaten ontwikkelen meetbare tumoren tegen 3 weken na implantatie. Als ledematen met tumoren 3 weken na implantatie worden geamputeerd, is de incidentie van longmetastase aanzienlijk verminderd. Besturingssystemen zijn zowel osteolytisch als osteoblastisch. Ratten zonder amputatie ontwikkelen longmetastasen die meervoudig en variabel zijn, waargenomen door radiografie of bij obductie tegen 7 weken na implantatie. EGFR, ErbB2 en ErbB4 worden uitgedrukt in rat UMR106 OS, vergelijkbaar met het mens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH-financiering via het National Cancer Institute, subsidie # CA228582. Shun Ishiyama ontvangt momenteel een subsidie van Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189 (2014).
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Recherche en cancérologie. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
