मंडीबुलर मुरीन मॉडल में ऑर्थोडोन्टिक टूथ मूवमेंट के दौरान पीडीएल कोलेजन फाइबर की 3डी इमेजिंग
Summary
हम चूहों में ऑर्थोडोन्टिक दांत आंदोलन पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बिना किसी खंड के कोलेजन फाइबर और पीरियोडोन्टल स्नायु के रक्त वाहिकाओं के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन के तरीके हैं।
Abstract
ऑर्थोडोन्टिक दांत आंदोलन बाहरी ताकतों के परिणामस्वरूप नरम और कठोर ऊतक रीमॉडलिंग की एक जटिल जैविक प्रक्रिया है। इन जटिल रीमॉडलिंग प्रक्रियाओं को समझने के लिए, दांत और पीरियोडोन्टल ऊतकों को उनके 3 डी संदर्भ के भीतर अध्ययन करना महत्वपूर्ण है और इसलिए किसी भी खंड और ऊतक कलाकृतियों को कम करना महत्वपूर्ण है। माउस मॉडल का उपयोग अक्सर विकासात्मक और संरचनात्मक जीव विज्ञान में किया जाता है, साथ ही उनके छोटे आकार, उच्च मेटाबोलिक दर, आनुवंशिकी और हैंडलिंग में आसानी के कारण बायोमैकेनिक्स में भी उपयोग किया जाता है। सिद्धांत रूप में यह उन्हें दंत चिकित्सा से संबंधित अध्ययनों के लिए उत्कृष्ट मॉडल भी बनाता है। हालांकि, एक बड़ी बाधा उनके छोटे दांत का आकार, विशेष रूप से मोलर्स है। इस पेपर का उद्देश्य ऑर्थोडोन्टिक दांत आंदोलन पैदा करने के लिए एक कदम प्रोटोकॉल और माउस मंडीबुलर मोलर के पीरियोडोन्टल स्नायु रेशेदार घटक के 3 डी इमेजिंग के लिए दो तरीकों को प्रदान करना है। प्रस्तुत पहली विधि एक माइक्रो सीटी सेटअप पर आधारित है जो ताजा कोलेजन ऊतकों के चरण वृद्धि इमेजिंग को सक्षम करता है। दूसरी विधि एथिल सिनामेट का उपयोग करके एक हड्डी समाशोधन विधि है जो बिना किसी सेक्शनिंग के हड्डी के माध्यम से इमेजिंग को सक्षम बनाती है और अंतर्जात फ्लोरेसेंस को बरकरार रखता है। Flk1– Cre जैसे रिपोर्टर चूहों के साथ इस समाशोधन विधिकासंयोजन; TdTomato ने पीडीएल और अल्वेलार हड्डी में 3 डी वैक्यूलेचर को छवि देने के लिए अपनी तरह का पहला अवसर प्रदान किया।
Introduction
ऑर्थोडोन्टिक टूथ मूवमेंट (ओटीएम) में मूल अंतर्निहित जैविक प्रक्रिया बोन रीमॉडलिंग है। इस रीमॉडलिंग प्रक्रिया के लिए ट्रिगर को पीरियोडोन्टल स्नायु (पीडीएल) जैसे एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) तनाव, परिगलन के साथ-साथ रक्त वाहिका विनाश औरगठन 1,2,3की संरचना में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। अल्वेलर बोन रीमॉडलिंग के लिए अन्य संभावित ट्रिगर हड्डी में ऑस्टियोसाइट्स द्वारा बल संवेदन के साथ-साथ अल्वेलर हड्डी के यांत्रिक विरूपण से संबंधित हैं; हालांकि ओटीएम में उनकी भूमिका अभी भी पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है4,5.
ओटीएम के दौरान पीडीएल के संरचना-कार्य संबंधों को उजागर करने के उद्देश्य से कई अध्ययनों के बावजूद, एक स्पष्ट कार्यात्मक तंत्र को अभी तक परिभाषित किया जाना है6,7। इसका प्रमुख कारण दो कठोर ऊतकों (सीमेंटम और अल्वियोलर हड्डी) के बीच स्थित एक नरम ऊतक (पीडीएल) के डेटा को वापस लाने में चुनौती है। संरचनात्मक जानकारी एकत्र करने के लिए स्वीकार किए जाते हैं तरीकों आमतौर पर निर्धारण और खंड है कि बाधित और पीडीएल संरचना को संशोधित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, इनमें से अधिकांश तरीके 2D डेटा प्राप्त करते हैं जो भले ही विकृत न हो, केवल आंशिक और स्थानीयकृत जानकारी दें। चूंकि पीडीएल इसकी संरचना और कार्य में एक समान नहीं है, इसलिए एक दृष्टिकोण जो पूरे दांत-पीडीएल-हड्डी परिसर की अक्षुण्ण 3 डी संरचना को संबोधित करता है।
यह पेपर चूहों में ओटीएम पैदा करने के लिए एक विधि और दो तरीकों का वर्णन करेगा जो नमूने के किसी भी खंड के बिना पीडीएल में कोलेजन फाइबर के 3 डी दृश्य को सक्षम करते हैं।
मुरीन मॉडल व्यापक रूप से चिकित्सा, विकासात्मक जीव विज्ञान, दवा वितरण और संरचनात्मक अध्ययन में में वीवो प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है । वे आनुवंशिक रूप से समाप्त करने या विशिष्ट प्रोटीन और कार्य को बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है; वे तेजी से, दोहराने योग्य और उम्मीद के मुताबिक विकास नियंत्रण प्रदान करते हैं; वे भी अपने छोटे आकार8कारण इमेज करने के लिए आसान कर रहे हैं . उनके कई फायदों के बावजूद, दंत चिकित्सा अनुसंधान में माउस मॉडल का उपयोग अक्सर नहीं किया जाता है, खासकर जब नैदानिक जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है, ज्यादातर छोटे आकार के दांतों के कारण। चूहों9,10, 11,कुत्तों12, 13,सूअर14,15,16और बंदरों 17जैसे पशु मॉडल चूहों की तुलना में अधिक बार उपयोग किए जाते हैं। उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों के हालिया विकास के साथ, ओटीएम में जटिल प्रक्रियाओं को समझने के लिए माउस मॉडल का उपयोग करने के फायदे कई हैं। यह पेपर लगातार बल स्तर के साथ मंडीबल में मोलर दांत का एक मेसियल आंदोलन उत्पन्न करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है जो हड्डी के रीमॉडलिंग को ट्रिगर करता है। कृंतक में अधिकांश ओटीएम प्रयोग मैक्सिला में किए जाते हैं, क्योंकि मंडली की गतिशीलता और जीभ की उपस्थिति एक और जटिलता स्तर जोड़ती है। हालांकि, 3 डी संरचनात्मक अखंडता वांछित होने पर मंडीबल के कई फायदे हैं। इसे पूरी हड्डी के रूप में आसानी से विच्छेदित किया जा सकता है; कुछ प्रजातियों में इसे रेशेदार सिम्फिसिस के माध्यम से दो हेमी-मंडलियों में अलग किया जा सकता है; यह कॉम्पैक्ट, फ्लैट है और इसमें बिना किसी साइनस रिक्त स्थान के केवल दांत होते हैं। इसके विपरीत, मैक्सिला खोपड़ी का एक हिस्सा है और अन्य अंगों और संरचनाओं से निकटता से संबंधित है, इस प्रकार संबंधित दांतों के साथ अल्वेलर हड्डी को विच्छेदन करने के लिए व्यापक खंड की आवश्यकता होती है।
एक उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रो-सीटी के अंदर एक लोडिंग प्रणाली के साथ मिलकर घर में आर्द्रता कक्ष का उपयोग करना जो चरण वृद्धि को सक्षम बनाता है, हमने 3 डी में ताजा रेशेदार ऊतकों की कल्पना करने के लिए एक विधि विकसित की, जैसाकि पहले9,18,19,20,21,22, 23वर्णित है। जानवर को बिना किसी धुंधला या निर्धारण के बलिदान करने के तुरंत बाद ताजा ऊतकों को स्कैन किया जाता है, जो ऊतक कलाकृतियों के साथ-साथ बायोमैकेनिकल गुणों के परिवर्तन को कम करता है। इन 3डी डेटा का उपयोग19और वर्णित फाइबर के वितरण और दिशा विश्लेषण के लिए किया जा सकता है ।
यहां प्रस्तुत दूसरी 3 डी पूरी ऊतक इमेजिंग विधि मंडीबल के ऑप्टिकल समाशोधन पर आधारित है जो बिना किसी खंड के हड्डी के माध्यम से पीडीएल फाइबर की इमेजिंग को सक्षम बनाता है। दिलचस्प बात यह भी हड्डी के कोलेजन फाइबर के दृश्य सक्षम बनाता है, लेकिन यह यहां चर्चा नहीं की जाएगी । सामान्य तौर पर, ऊतक समाशोधन के लिए दो तरीके हैं। पहला जलीय-आधारित समाशोधन है जहां नमूना एक सरल विसर्जन, हाइपरहाइड्रेशन या हाइड्रोगेल एम्बेडिंग के माध्यम से 1.4 से अधिक अपवर्तक सूचकांक के साथ एक जलीय समाधान में डूबा हुआ है। हालांकि, यह विधि पारदर्शिता के स्तर के साथ-साथ ऊतक के संरचनात्मक संरक्षण में सीमित है और इसलिए ऊतक के निर्धारण की आवश्यकता होती है। दूसरी विधि जिसमें अत्यधिक पारदर्शी नमूने लिए जाते हैं और निर्धारण की आवश्यकता नहीं होती है, वह है सॉल्वेंट-आधारित समाशोधन विधि24,25. हमने मंडीबुलर नमूनों के लिए एथिल-3-फेनिलोप-2-एनोएट (एथिल सिनामेट, ईसीआई) के आधार पर एक संशोधित सॉल्वेंट-आधारित समाशोधन विधि उत्पन्न की। इस विधि में गैर-विषाक्त खाद्य-ग्रेड समाशोधन एजेंट, न्यूनतम ऊतक सिकुड़न और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संरक्षण का उपयोग करने के फायदे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आकार, आनुवंशिकी और हैंडलिंग लाभ के कारण चूहों में ओटीएम उत्पन्न करना अत्यधिक वांछित है। मंडीबल का उपयोग ऊतक विच्छेदन के साथ-साथ नमूना तैयारी और इमेजिंग दोनों के मामले में एक आसान हैंडलिंग प्रदान करता …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को एनआईएच (एनआईडीसीआर आर00- डीई025053, पीआई:नवेह) द्वारा समर्थित किया गया था। हम बुनियादी ढांचे और समर्थन के लिए जैविक इमेजिंग के लिए हार्वर्ड सेंटर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । सभी आंकड़े biorender.com के साथ उत्पन्न होते हैं।
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
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