3D Imaging af PDL Kollagen Fibre under ortodontisk tand bevægelse i Mandibular Murine Model

Summary

Vi præsenterer en protokol for generering af ortodontisk tandbevægelse i mus og metoder til 3D-visualisering af kollagenfibre og blodkar af parodontal ligament uden sektionsopdelt.

Abstract

Ortodontisk tand bevægelse er en kompleks biologisk proces med ændret blødt og hårdt væv remodeling som følge af eksterne kræfter. For at forstå disse komplekse ombygningsprocesser er det afgørende at studere tand- og parodontale væv inden for deres 3D-kontekst og derfor minimere eventuelle sektions- og vævsgenstande. Musemodeller bruges ofte i udviklings- og strukturbiologi såvel som i biomekanik på grund af deres lille størrelse, høje stofskifte, genetik og nem håndtering. I princippet gør dette dem også fremragende modeller til tandrelaterede undersøgelser. Men en stor hindring er deres lille tandstørrelse, især molarerne. Dette papir har til formål at give en trin for trin protokol for at generere ortodontiske tand bevægelse og to metoder til 3D-billeddannelse af parodontale ligament fiberkomponenten i en mus mandibular molar. Den første præsenterede metode er baseret på en mikro-CT setup muliggør fase ekstraudstyr billeddannelse af friske kollagen væv. Den anden metode er en knoglerydningsmetode ved hjælp af ethylcinnamat, der muliggør billeddannelse gennem knoglen uden at sektionsopdele og bevarer endogen fluorescens. Kombination af denne clearingmetode med reportermus som Flk1–Cre; TdTomato gav en første af sin slags mulighed for at afbilde 3D-vaskulaturen i PDL- og alveolarbenet.

Introduction

Den grundlæggende underliggende biologiske proces i ortodontisk tand bevægelse (OTM) er knogle remodeling. Udløseren til denne remodeling proces tilskrives ændringer i strukturen af parodontale ligament (PDL) såsom ekstracellulær matrix (ECM) stress, nekrose samt blodkar ødelæggelse og^{dannelse 1,2,3}. Andre mulige udløsere til alveolar knogle remodeling er relateret til kraft sensing af osteocytter i knoglen, samt mekanisk deformation af alveolar knoglen selv; deres rolle i OTM er dog stadig ikke fuldt ud belyst^4,5.

På trods af mange undersøgelser, der har til formål at afsløre PDL’s strukturfunktionsrelationer under OTM , er der endnu ikke defineret en klar funktionel mekanisme^6,7. Hovedårsagen til dette er udfordringen med at hente data fra et blødt væv (PDL) placeret mellem to hårde væv (cementum og alveolar knogle). De accepterede metoder til at indsamle strukturelle oplysninger kræver normalt fiksering og sektionsopderinger, der forstyrrer og ændrer PDL-strukturen. Desuden giver de fleste af disse metoder 2D-data, der, selvom de ikke fordrejes, kun giver delvise og lokaliserede oplysninger. Da PDL ikke er ensartet i sin struktur og funktion, er en tilgang, der adresserer den intakte 3D-struktur i hele tand-PDL-knoglekomplekset, berettiget.

Dette papir vil beskrive en metode til at generere en OTM i mus og to metoder, der muliggør 3D-visualisering af kollagenfibrene i PDL uden nogen opdeling af prøven.

Murine modeller er meget udbredt til in-vivo eksperimenter inden for medicin, udviklingsbiologi, medicin levering og strukturelle undersøgelser. De kan genetisk modificeres for at fjerne eller forbedre specifikke proteiner og funktioner; de giver hurtig, repeterbar og forudsigelig udviklingsmæssig kontrol de er også nemme at billedet på grund af deres lille størrelse⁸. På trods af deres mange fordele anvendes musemodeller i tandforskning ikke ofte, især når kliniske manipulationer er berettiget, hovedsagelig på grund af de små tænder. Dyremodeller som rotter^9,10,11, hunde^12,13,grise^14,15,16 og aber¹⁷ bruges oftere end mus. Med den nylige udvikling af høj opløsning billedbehandling teknikker, fordelene ved at bruge en mus model til at dechifrere de indviklede processer i OTM er talrige. Dette papir præsenterer en metode til at generere en mesial bevægelse af molar tand i underkæben med konstant kraft niveauer, der udløser knogle remodeling. De fleste OTM-eksperimenter i gnavere udføres i maxillaen, da mandiblens mobilitet og tilstedeværelsen af tungen tilføjer et andet kompleksitetsniveau. Men underkæbe har mange fordele, når 3D strukturel integritet ønskes. Det kan let dissekeres som en hel knogle; i nogle arter kan det opdeles i to hemi-mandibler gennem fiber symphysis; den er kompakt, flad og indeholder kun tænderne uden sinus rum. I modsætning hertil er maxillaen en del af kraniet og tæt forbundet med andre organer og strukturer, således er omfattende sektionsopdelte nødvendige for at dissekere alveolarbenet med de tilhørende tænder.

Ved hjælp af en in house fugtighed kammer koblet til en lastning system inde i en høj opløsning mikro-CT, der muliggør fase ekstraudstyr, vi udviklet en metode til at visualisere friske fibervæv i 3D som tidligere beskrevet^{9,18,19,20,21,22,23}. Frisk væv scannes umiddelbart efter, at dyret er ofret uden farvning eller fiksering, hvilket reducerer vævsgenstande samt ændringer af biomekaniske egenskaber. Disse 3D-data kan bruges til distributions- og retningsanalyser af fibrene som beskrevet andetsteds¹⁹.

Den anden 3D hele væv billeddannelse metode præsenteret her er baseret på optisk clearing af mandiblen, som gør det muligt billeddannelse af PDL fibre gennem knoglen uden nogen sektion. Interessant det gør det også muligt visualisering af kollagen fibre af knoglen selv, men dette vil ikke blive diskuteret her. Generelt er der to metoder til vævsrydning. Den første er vandig-baseret clearing, hvor prøven er nedsænket i en vandig opløsning med et brydningsindeks større end 1,4 enten gennem en simpel nedsænkning, hyperhydrering eller hydrogel indlejring. Denne metode er imidlertid begrænset i graden af gennemsigtighed såvel som den strukturelle bevarelse af vævet og kræver derfor fiksering af vævet. Den anden metode, der giver meget gennemsigtige prøver og ikke kræver fiksering, er den opløsningsmiddelbaserede clearingmetode^24,25. Vi genererede en modificeret opløsningsmiddelbaseret clearingmetode baseret på ethyl-3-phenylprop-2-enoate (ethylcinnamat, ECi) til mandibularprøverne. Denne metode har fordelene ved at bruge ikke-giftige fødevarer-grade clearing agent, minimal væv svind, og bevarelse af fluorescerende proteiner.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med NIH’s retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr og retningslinjer fra Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokol nr. 01840). 1. Ortodontisk tand bevægelse For at generere en museseng skal du bruge en flad plastplatform med en kileformet, 45° vinklet nakkestøtte. Nakkestøtten kan genereres ved at skære en plastikkasse. Løft platformens hovedende for at generere en ca. 30° vinkel mel…

Representative Results

Dette papir præsenterer en metode til at producere OTM samt to metoder til 3D-billeddannelse af kollagenfibre inde i PDL uden nogen sektion. Til dyreforskningsformål, når tilpasning af tænderne ikke er nødvendig, betragtes en tandbevægelse som ortodontisk, hvis den genererer remodeling af alveolarbenet på alle rodniveauer. Konstant kraftniveau, der påføres tænder, er påkrævet for at generere en pålidelig OTM. Her bruges en aktiveret form-hukommelse NiTi spole til at generere en ensartet kraft på 10 g i hele…

Discussion

Generering af OTM hos mus er meget ønsket på grund af størrelse, genetik og håndteringsfordele. Brug af mandiblen giver en nem håndtering både med hensyn til vævsdissektion samt prøveforberedelse og billeddannelse. Her præsenterede vi en metode til at generere OTM med translationel bevægelse af tanden inde i knoglen inden for 7 dage efter OTM. Ved hjælp af denne protokol kan tandbevægelsens samlede varighed forlænges, da den aktiverede spole leverer et konstant kraftniveau for bevægelse på op til ca. 1 mm….

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2