Imagerie 3D des fibres de collagène PDL pendant le mouvement orthodontique des dents dans le modèle murin mandibulaire

Summary

Nous présentons un protocole pour générer le mouvement orthodontique de dent chez les souris et des méthodes pour la visualisation 3D des fibres de collagène et des vaisseaux sanguins du ligament parodontal sans sectionnement.

Abstract

Le mouvement orthodontique des dents est un processus biologique complexe de remodelage des tissus mous et durs altérés à la suite de forces externes. Afin de comprendre ces processus de remodelage complexes, il est essentiel d’étudier la dent et les tissus parodontals dans leur contexte 3D et donc de minimiser les sectionnements et les artefacts tissulaires. Les modèles murins sont souvent utilisés en biologie du développement et de la structure, ainsi qu’en biomécanique en raison de leur petite taille, de leur taux métabolique élevé, de leur génétique et de leur facilité de manipulation. En principe, cela en fait également d’excellents modèles pour les études dentaires. Cependant, un obstacle majeur est leur petite taille de dent, les molaires en particulier. Ce document vise à fournir un protocole étape par étape pour générer le mouvement orthodontique de dent et deux méthodes pour la formation image 3D du composant fibreux périodontique de ligament d’une molaire mandibulaire de souris. La première méthode présentée est basée sur une installation de micro-CT permettant l’imagerie d’amélioration de phase des tissus frais de collagène. La deuxième méthode est une méthode de nettoyage osseux utilisant du cinnamate d’éthyle qui permet l’imagerie à travers l’os sans sectionnement et préserve la fluorescence endogène. Combinant cette méthode de compensation avec des souris reporters comme Flk1–Cre; TdTomato a fourni une première occasion du genre d’imager la vascularisation 3D dans le PDL et l’os alvéolaire.

Introduction

Le processus biologique sous-jacent de base dans le mouvement orthodontique des dents (OTM) est le remodelage osseux. Le déclencheur de ce processus de remodelage est attribué à des changements dans la structure du ligament parodontal (PDL) tels que le stress de la matrice extracellulaire (ECM), la nécrose ainsi que la destruction et la formation des vaisseaux sanguins^1,2,3. D’autres déclencheurs possibles pour le remodelage alvéolaire d’os sont liés à la détection de force par les ostéocytes dans l’os, ainsi qu’à la déformation mécanique de l’os alvéolaire lui-même; cependant leur rôle dans OTM n’est pas encore entièrement élucidé^4,5.

Malgré de nombreuses études visant à révéler les relations structure-fonction du PDL au cours de l’OTM, un mécanisme fonctionnel clair doit encore être défini^6,7. La raison principale en est le défi de récupérer les données d’un tissu mou (PDL) situé entre deux tissus durs (cénume et os alvéolaire). Les méthodes acceptées pour recueillir des informations structurelles nécessitent généralement une fixation et un sectionnement qui perturbent et modifient la structure PDL. De plus, la plupart de ces méthodes produisent des données 2D qui, même si elles ne sont pas déformées, ne donnent que des informations partielles et localisées. Puisque le PDL n’est pas uniforme dans sa structure et fonction, une approche qui adresse la structure 3D intacte du complexe entier de dent-PDL-os est justifiée.

Cet article décrira une méthode pour générer un OTM chez la souris et deux méthodes qui permettent la visualisation 3D des fibres de collagène dans le PDL sans aucune section de l’échantillon.

Les modèles murins sont largement utilisés pour les expériences in vivo en médecine, en biologie du développement, en administration de médicaments et en études structurelles. Ils peuvent être génétiquement modifiés pour éliminer ou améliorer des protéines et des fonctions spécifiques; ils fournissent un contrôle du développement rapide, reproductible et prévisible; ils sont également faciles à imager en raison de leur petite taille⁸. Malgré leurs nombreux avantages, les modèles murins dans la recherche dentaire ne sont pas utilisés fréquemment, en particulier lorsque des manipulations cliniques sont justifiées, principalement en raison des dents de petite taille. Des modèles animaux tels que les rats^9,10,11,les chiens^12,13,les porcs^14,15,16 et les singes¹⁷ sont utilisés plus souvent que les souris. Avec le développement récent de techniques d’imagerie haute résolution, les avantages de l’utilisation d’un modèle murin pour déchiffrer les processus alambiqués dans OTM sont nombreux. Ce document présente une méthode pour générer un mouvement mesial de la dent molaire dans la mâchoire inférieure avec les niveaux constants de force qui déclenchent la retouche d’os. La plupart des expériences OTM chez les rongeurs sont faites dans le maxillaire supérieur, puisque la mobilité de la mandibule et la présence de la langue ajoutent un autre niveau de complexité. Cependant, la mandibule présente de nombreux avantages lorsque l’intégrité structurelle 3D est souhaitée. Il peut être facilement disséqué comme un os entier; chez certaines espèces, il peut être séparé en deux hémi-mandibules par la symphyse fibreuse; il est compact, plat et ne contient que les dents sans aucun espace sinusal. En revanche, le maxillaire supérieur fait partie du crâne et est étroitement lié à d’autres organes et structures, donc une section étendue est nécessaire afin de disséquer l’os alvéolaire avec les dents associées.

En utilisant une chambre d’humidité interne couplée à un système de chargement à l’intérieur d’un micro-CT haute résolution qui permet une amélioration de phase, nous avons développé une méthode pour visualiser les tissus fibreux frais en 3D comme décrit précédemment^{9,18,19,20,21,22,23.} Les tissus frais sont scannés immédiatement après le sacrifice de l’animal sans aucune coloration ou fixation, ce qui réduit les artefacts tissulaires ainsi que les altérations des propriétés biomécaniques. Ces données 3D peuvent être utilisées pour la distribution et les analyses de direction des fibres comme décrit ailleurs^19.

La deuxième méthode d’imagerie tissulaire entier 3D présentée ici est basée sur la clairance optique de la mandibule qui permet l’imagerie des fibres PDL à travers l’os sans aucune section. Fait intéressant, il permet également la visualisation des fibres de collagène de l’os lui-même, mais cela ne sera pas discuté ici. En général, il existe deux méthodes pour la clairance tissulaire. Le premier est le déblaiement à base aqueuse où l’échantillon est immergé dans une solution aqueuse avec un indice de réfraction supérieur à 1,4 soit par une simple immersion, hyperhydratation ou incorporation d’hydrogel. Cependant, cette méthode est limitée dans le niveau de transparence ainsi que la préservation structurelle du tissu et nécessite donc la fixation du tissu. La seconde méthode qui donne des échantillons très transparents et ne nécessite pas de fixation est la méthode de compensation à base de solvant^24,25. Nous avons généré une méthode de compensation modifiée à base de solvant basée sur le 3-phénylprop-2-énoate d’éthyle (cinnamate d’éthyle, ECi) pour les échantillons mandibulaires. Cette méthode présente les avantages d’utiliser un agent de compensation de qualité alimentaire non toxique, un rétrécissement minimal des tissus et la conservation des protéines fluorescentes.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux Lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Harvard (Protocole no 01840). 1. Mouvement orthodontique des dents Pour générer un lit de souris, utilisez une plate-forme en plastique plat avec un appui-tête incliné de 45 ° en forme de coin. L’app…

Representative Results

Ce document présente une méthode pour produire OTM aussi bien que deux méthodes pour la formation image 3D des fibres de collagène à l’intérieur du PDL sans n’importe quelle sectionnement. À des fins de recherche sur les animaux, lorsque l’alignement des dents n’est pas nécessaire, un mouvement dentaire est considéré comme orthodontique s’il génère un remodelage de l’os alvéolaire à tous les niveaux racinaires. Un niveau de force constant appliqué sur les dents est nécessaire afin de générer…

Discussion

La génération d’OTM chez la souris est fortement souhaitée en raison de la taille, de la génétique et des avantages de la manipulation. L’utilisation de la mandibule permet une manipulation facile à la fois en termes de dissection tissulaire ainsi que de préparation des échantillons et d’imagerie. Ici nous avons présenté une méthode pour générer OTM avec le mouvement translationnel de la dent à l’intérieur de l’os dans les 7 jours d’OTM. En utilisant ce protocole, la durée globale du mouvement…

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2