JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie du développement

Isolation og Time-Lapse Imaging af primær mus embryonale Palatal Mesenchyme Celler til at analysere kollektive bevægelse attributter

Published: February 13, 2021
doi:
10.3791/62151
, , ,
1Department of Anatomy and Cell Biology,University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics,Eotvos University

Summary

Vi præsenterer en protokol for isolering og kultur af primære mus embryonale palatal mesenchymale celler for time-lapse billeddannelse af to-dimensionelle (2D) vækst og sår-reparation assays. Vi leverer også metoden til analyse af time-lapse imaging data til at bestemme celle-stream dannelse og retningsbestemt motilitet.

Abstract

Udvikling af ganen er en dynamisk proces, som indebærer vertikal vækst af bilaterale palatal hylder ved siden af tungen efterfulgt af elevation og fusion over tungen. Defekter i denne proces fører til ganespalte, en almindelig fødselsdefekt. Nylige undersøgelser har vist, at palatal hylde elevation indebærer en remodeling proces, der forvandler orienteringen af hylden fra en lodret til en vandret. Den rolle, som palatal hylde mesenchymal celler i denne dynamiske remodeling har været vanskeligt at studere. Time-lapse-imaging-baseret kvantitativ analyse er for nylig blevet brugt til at vise, at primære mus embryonale palatal mesenchymale (MEPM) celler kan selv-organisere sig i en kollektiv bevægelse. Kvantitative analyser kan identificere forskelle i mutante MEPM-celler fra en musemodel med ganehøjdefejl. Dette papir beskriver metoder til at isolere og kultur MEPM celler fra E13.5 embryoner-specifikt for time-lapse imaging-og til at bestemme forskellige cellulære attributter af kollektiv bevægelse, herunder foranstaltninger for strøm dannelse, form justering, og vedholdenhed i retning. Det postulerer, at MEPM-celler kan tjene som en proxymodel til at studere rollen som palatal hylde mesenchyme under den dynamiske elevationsproces. Disse kvantitative metoder vil gøre det muligt for efterforskere i kraniofacial område at vurdere og sammenligne kollektive bevægelse attributter i kontrol og mutant celler, som vil øge forståelsen af mesenchymal remodeling under palatal hylde elevation. Desuden giver MEPM-celler en sjælden mesenkymal cellemodel til undersøgelse af kollektiv cellebevægelse generelt.

Introduction

Gane udvikling er blevet undersøgt udførligt som defekter i palatogenese føre til ganespalte-en fælles fødselsdefekt, der opstår i isolerede tilfælde eller som en del af hundredvis af syndromer1,2. Udviklingen af den embryonale gane er en dynamisk proces, der involverer bevægelse og fusion af embryonalt væv. Denne proces kan opdeles i fire store trin: 1) induktion af palatale hylder, 2) lodret vækst af palatal hylderne ved siden af tungen, 3) højde af palatal hylder over tungen, og 4) fusion af palatal hylder i midten af1,3,4. I løbet af de sidste mange årtier er mange musemutanter blevet identificeret, at åbenbar ganespalte5,6,7,8. Karakterisering af disse modeller har angivet fejl i palatal hylde induktion, spredning, og fusion trin; Det har dog været sjældent, at der er ophøjet en palatal hylde. Således er forståelse af dynamikken i palatal hyldehøjde et spændende forskningsområde.

Omhyggelig analyse af nogle musemutanter med palatal hylde elevation defekter har ført til den nuværende model viser, at den meget forreste region af palatal hylde synes at vende op, mens en lodret til vandret bevægelse eller “remodeling” af palatal hylder forekommer i midten til posterior regioner i ganen1,3,4, 9,10,11. Den mediale kant epitel af palatal hylden sandsynligvis indleder signalering kræves for denne ombygning, som derefter drives af palatal hylde mesenchyme. For nylig har mange forskere identificeret palatal hylde elevation forsinkelse i musemodeller, der viste forbigående mundtlige vedhæftninger involverer palatal hylder12,13. Den mesenchymale remodeling indebærer reorganisering af cellerne for at skabe en bule i vandret retning, samtidig med at den palatale hylde trækkes tilbage i lodret retning9,10,14. Blandt de mange mekanismer , der foreslås at påvirke palatal hyldehøjde og den underliggende mesenkymale remodeling, er cellespredning15,16,17, chemotactic gradienter18og ekstracellulære matrixkomponenter19,20. Et vigtigt spørgsmål opstod: er palatal hylde elevation forsinkelse observeret i Specc1l-mangelfuldmus også delvis på grund af en defekt i palatal hylde remodeling, og kunne denne remodeling defekt manifestere sig i en iboende defekt i adfærd primære MEPM celler21?

Primære MEPM-celler er blevet anvendt i kraniofacialområdet til mange undersøgelser, der involverer genekspression22,23,24,25,26,27,28,29og nogle få, der involverer spredning30,31 og migration25,31,32 , men ingen til analyse af kollektiv cellefunktionsmåde. Time-lapse imaging af MEPM celler blev udført i 2D-kultur og sår-reparation assays at vise, at MEPM celler vises retningsbestemt bevægelse og dannede tæthed-afhængige celle streams-attributter af kollektiv bevægelse21. Desuden dannede Specc1l mutantceller smallere cellestrømme og viste meget variable cellemigrationsbaner. Denne mangel på koordineret motilitet anses for at bidrage til den gane elevation forsinkelse i Specc1l mutant embryoner13,21. Således kan disse relativt enkle analyser ved hjælp af primære MEPM-celler tjene som en proxy for at studere mesenkymal remodeling under palatal hylde elevation. Dette papir beskriver isolation og kultur af primære MEPM celler, samt time-lapse billeddannelse og analyse, for 2D og sår-reparation assays.

Protocol

Alle forsøg med dyr blev udført med en protokol, der blev godkendt af KUMC Institutional Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med deres retningslinjer og bestemmelser (protokolnummer: 2018-2447). 1. Høst E13.5 embryoner Aflive gravide hunmus ved hjælp af et CO 2-inhalationskammer eller efter en procedure, der er godkendt af udvalget for institutionel dyrepleje og -anvendelse. Gå straks videre til dissektion. Eksponer den ringere halvdel af bughul…

Representative Results

Dissektionen af palatalhylder er illustreret i figur 1. Sekvensen af snit er designet til at minimere skred af vævet. Efter fjernelsen af hovedet (Figur 1A, B), fjernes underkæben ( Figur1B, C). Snittet i den øverste del af hovedet (Figur 1C, D ) gøres for at stabiliserevævet,når det placeres på hovedet (Figur 1E) fo…

Discussion

Palatal hyldehøjde udgør en lodret til vandret ombygningshændelse1,3,4,9,11. Det er postuleret, at denne remodeling proces kræver palatal hylde mesenchymale celler til at opføre sig koordinat. Analyserne med jokertegn MEPM-celler viser, at denne cellefunktion er iboende og kan kvantificeres21. Således kan disse analyser bruges til…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette projekt blev delvist støttet af National Institutes of Health Grants DE026172 (I.S.) og GM102801 (A.C.). I.S. blev også delvist støttet af Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) tilskud (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) og Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) grant (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Biologie du développement. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).

Tags

Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme CellsTime-lapse ImagingCollective Movement AttributesPalatal Shelf ElevationCraniofacial FieldMesenchymal RemodelingEmbryonic Day 13.5Palatal ShellMEPM Culture MediumFine ForcepsStainless Steel ScissorsCell Isolation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image