Vi præsenterer en protokol for isolering og kultur af primære mus embryonale palatal mesenchymale celler for time-lapse billeddannelse af to-dimensionelle (2D) vækst og sår-reparation assays. Vi leverer også metoden til analyse af time-lapse imaging data til at bestemme celle-stream dannelse og retningsbestemt motilitet.
Udvikling af ganen er en dynamisk proces, som indebærer vertikal vækst af bilaterale palatal hylder ved siden af tungen efterfulgt af elevation og fusion over tungen. Defekter i denne proces fører til ganespalte, en almindelig fødselsdefekt. Nylige undersøgelser har vist, at palatal hylde elevation indebærer en remodeling proces, der forvandler orienteringen af hylden fra en lodret til en vandret. Den rolle, som palatal hylde mesenchymal celler i denne dynamiske remodeling har været vanskeligt at studere. Time-lapse-imaging-baseret kvantitativ analyse er for nylig blevet brugt til at vise, at primære mus embryonale palatal mesenchymale (MEPM) celler kan selv-organisere sig i en kollektiv bevægelse. Kvantitative analyser kan identificere forskelle i mutante MEPM-celler fra en musemodel med ganehøjdefejl. Dette papir beskriver metoder til at isolere og kultur MEPM celler fra E13.5 embryoner-specifikt for time-lapse imaging-og til at bestemme forskellige cellulære attributter af kollektiv bevægelse, herunder foranstaltninger for strøm dannelse, form justering, og vedholdenhed i retning. Det postulerer, at MEPM-celler kan tjene som en proxymodel til at studere rollen som palatal hylde mesenchyme under den dynamiske elevationsproces. Disse kvantitative metoder vil gøre det muligt for efterforskere i kraniofacial område at vurdere og sammenligne kollektive bevægelse attributter i kontrol og mutant celler, som vil øge forståelsen af mesenchymal remodeling under palatal hylde elevation. Desuden giver MEPM-celler en sjælden mesenkymal cellemodel til undersøgelse af kollektiv cellebevægelse generelt.
Gane udvikling er blevet undersøgt udførligt som defekter i palatogenese føre til ganespalte-en fælles fødselsdefekt, der opstår i isolerede tilfælde eller som en del af hundredvis af syndromer1,2. Udviklingen af den embryonale gane er en dynamisk proces, der involverer bevægelse og fusion af embryonalt væv. Denne proces kan opdeles i fire store trin: 1) induktion af palatale hylder, 2) lodret vækst af palatal hylderne ved siden af tungen, 3) højde af palatal hylder over tungen, og 4) fusion af palatal hylder i midten af1,3,4. I løbet af de sidste mange årtier er mange musemutanter blevet identificeret, at åbenbar ganespalte5,6,7,8. Karakterisering af disse modeller har angivet fejl i palatal hylde induktion, spredning, og fusion trin; Det har dog været sjældent, at der er ophøjet en palatal hylde. Således er forståelse af dynamikken i palatal hyldehøjde et spændende forskningsområde.
Omhyggelig analyse af nogle musemutanter med palatal hylde elevation defekter har ført til den nuværende model viser, at den meget forreste region af palatal hylde synes at vende op, mens en lodret til vandret bevægelse eller “remodeling” af palatal hylder forekommer i midten til posterior regioner i ganen1,3,4, 9,10,11. Den mediale kant epitel af palatal hylden sandsynligvis indleder signalering kræves for denne ombygning, som derefter drives af palatal hylde mesenchyme. For nylig har mange forskere identificeret palatal hylde elevation forsinkelse i musemodeller, der viste forbigående mundtlige vedhæftninger involverer palatal hylder12,13. Den mesenchymale remodeling indebærer reorganisering af cellerne for at skabe en bule i vandret retning, samtidig med at den palatale hylde trækkes tilbage i lodret retning9,10,14. Blandt de mange mekanismer , der foreslås at påvirke palatal hyldehøjde og den underliggende mesenkymale remodeling, er cellespredning15,16,17, chemotactic gradienter18og ekstracellulære matrixkomponenter19,20. Et vigtigt spørgsmål opstod: er palatal hylde elevation forsinkelse observeret i Specc1l-mangelfuldmus også delvis på grund af en defekt i palatal hylde remodeling, og kunne denne remodeling defekt manifestere sig i en iboende defekt i adfærd primære MEPM celler21?
Primære MEPM-celler er blevet anvendt i kraniofacialområdet til mange undersøgelser, der involverer genekspression22,23,24,25,26,27,28,29og nogle få, der involverer spredning30,31 og migration25,31,32 , men ingen til analyse af kollektiv cellefunktionsmåde. Time-lapse imaging af MEPM celler blev udført i 2D-kultur og sår-reparation assays at vise, at MEPM celler vises retningsbestemt bevægelse og dannede tæthed-afhængige celle streams-attributter af kollektiv bevægelse21. Desuden dannede Specc1l mutantceller smallere cellestrømme og viste meget variable cellemigrationsbaner. Denne mangel på koordineret motilitet anses for at bidrage til den gane elevation forsinkelse i Specc1l mutant embryoner13,21. Således kan disse relativt enkle analyser ved hjælp af primære MEPM-celler tjene som en proxy for at studere mesenkymal remodeling under palatal hylde elevation. Dette papir beskriver isolation og kultur af primære MEPM celler, samt time-lapse billeddannelse og analyse, for 2D og sår-reparation assays.
Palatal hyldehøjde udgør en lodret til vandret ombygningshændelse1,3,4,9,11. Det er postuleret, at denne remodeling proces kræver palatal hylde mesenchymale celler til at opføre sig koordinat. Analyserne med jokertegn MEPM-celler viser, at denne cellefunktion er iboende og kan kvantificeres21. Således kan disse analyser bruges til…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev delvist støttet af National Institutes of Health Grants DE026172 (I.S.) og GM102801 (A.C.). I.S. blev også delvist støttet af Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) tilskud (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) og Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) grant (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |