Изоляция и покадровая визуализация первичных клеток эмбриональной небной мезенхимы мыши для анализа коллективных атрибутов движения
Summary
Мы представляем протокол выделения и культивации первичных эмбриональных небных мезенхимальных клеток мыши для покадровой визуализации двумерного (2D) роста и ран-восстановительных анализов. Мы также предоставляем методологию анализа данных покадровой визуализации для определения образования клеточного потока и направленной подвижности.
Abstract
Развитие неба – это динамичный процесс, который включает в себя вертикальный рост двусторонних небных полок рядом с языком с последующим возвышением и сращинием над языком. Дефекты в этом процессе приводят к расщелине неба, распространенному врожденному дефекту. Недавние исследования показали, что поднятие небной полки включает в себя процесс реконструкции, который преобразует ориентацию полки из вертикальной в горизонтальную. Роль мезенхимальных клеток небной полки в этом динамическом ремоделирование было трудно изучить. Количественный анализ на основе покадровой визуализации недавно был использован, чтобы показать, что первичные эмбриональные небные мезенхимальные клетки мыши (MEPM) могут самоорганизовываться в коллективное движение. Количественный анализ может выявить различия в мутантных клетках MEPM из мышиной модели с дефектами высоты неба. В этой статье описываются методы выделения и культивирования клеток MEPM из эмбрионов E13.5, специально для покадровой визуализации, и определения различных клеточных атрибутов коллективного движения, включая меры по формированию потока, выравниванию формы и сохранению направления. В нем утверждается, что клетки MEPM могут служить прокси-моделью для изучения роли мезенхимы небной полки во время динамического процесса подъема. Эти количественные методы позволят исследователям в черепно-лицевой области оценивать и сравнивать коллективные атрибуты движения в контрольных и мутантных клетках, что расширит понимание ремоделирования мезенхимальных мешков во время подъема небного шельфа. Кроме того, клетки MEPM обеспечивают редкую модель мезенхимальных клеток для исследования коллективного движения клеток в целом.
Introduction
Развитие неба было широко изучено, поскольку дефекты небного генеза приводят к расщелине неба – распространенному врожденном дефекту, который возникает в единичных случаях или как часть сотен синдромов1,2. Развитие эмбрионального неба является динамическим процессом, который включает в себя движение и слияние эмбриональной ткани. Этот процесс можно разделить на четыре основных этапа: 1) индукция небных полок, 2) вертикальный рост небных полок рядом с языком, 3) возвышение небных полок над языком и 4) слияние небных полок на средней линии1,3,4. За последние несколько десятилетий у многих мышиных мутантов были выявлены проявления расщелины неба5,6,7,8. Характеристика этих моделей показала дефекты на этапах индукции, пролиферации и слияния небной полки; однако дефекты высоты небных шельфов были редкими. Таким образом, понимание динамики возвышения небного шельфа является интригующей областью исследований.
Тщательный анализ некоторых мышиных мутантов с дефектами высоты небной полки привел к текущей модели, показывающей, что сама передняя область небной полки, по-видимому, переворачивается вверх, в то время как вертикальное к горизонтальному движению или «ремоделирование» небных полок происходит в средней и задней областях неба1,3,4, 9,10,11. Эпителий медиальной кромки небной полки, вероятно, инициирует передачу сигналов, необходимую для этого ремоделирования, которое затем приводится в действие мезенхимой небной полки. В последнее время многие исследователи выявили задержку подъема небной полки в мышиных моделях, которые показали преходящие пероральные спайки с участием небных полок12,13. Мезенхимальное ремоделирование предполагает реорганизацию клеток для создания выпуклости в горизонтальном направлении, одновременно втягивая небную полку в вертикальном направлении9,10,14. Среди нескольких механизмов, предложенных для воздействия на высоту небной полки и лежащее в основе мезенхимальное ремоделирование, – пролиферация клеток15,16,17,хемотаксические градиенты18и компоненты внеклеточного матрикса19,20. Возник важный вопрос: наблюдается ли задержка подъема небной полки у мышей с дефицитом Specc1l такжечастично из-за дефекта ремоделирования небной полки, и может ли этот дефект ремоделирования проявляться во внутреннем дефекте поведения первичных клеток MEPM21?
Первичные клетки MEPM использовались в черепно-лицевой области для многих исследований, включающих экспрессию генов22,23,24,25,26,27,28,29,и несколько, включающих пролиферацию30,31 и миграцию25,31,32 , но не для коллективного анализа поведения клеток. Покадровую визуализацию клеток MEPM проводили в 2D-культуре и раневосточных анализах, чтобы показать, что клетки MEPM демонстрируют направленное движение и формируют зависящие от плотности клеточные потоки-атрибуты коллективного движения21. Кроме того, мутантные клетки Specc1l образовывали более узкие клеточные потоки и демонстрировали сильно изменчивые траектории миграции клеток. Считается, что это отсутствие скоординированной подвижности способствует задержке подъема неба у мутантных эмбрионов Specc1l 13,21. Таким образом, эти относительно простые анализы с использованием первичных клеток MEPM могут служить прокси для изучения ремоделирования мезенхимальных веществ во время подъема небного шельфа. В этой статье описывается изоляция и культура первичных клеток MEPM, а также покадровая визуализация и анализ для 2D и ран-восстановительных анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возвышение небного шельфа представляет собой вертикальное и горизонтальное событиереконструкции 1,3,4,9,11. Постулируется, что этот процесс ремоделирования требует, чтобы клетки мезенхимального лож…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был частично поддержан грантами Национальных институтов здравоохранения DE026172 (I.S.) и GM102801 (A.C.). I.S. также частично поддерживался грантом Центра передовых биомедицинских исследований (COBRE) (Национальный институт общих медицинских наук P20 GM104936), грантом Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (Национальный институт общих медицинских наук P20 GM103418) и грантом Канзасского исследовательского центра интеллектуальных нарушений и нарушений развития (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Biologie du développement. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
