I denne protokol beskriver vi, hvordan man genererer murin primære epitel kolonmonomer direkte fra tarmkrypter. Vi tilbyder eksperimentelle tilgange til at generere sammenflydende monolayers på gennemtrængelige filtre, sammenflydende monolayers til ridseredning og biokemiske undersøgelser og sparsomme og sammenflydende monolayers til immunfluorescensanalyse.
Tarmepitelet består af et enkelt lag celler, der fungerer som en barriere mellem tarmens lumen og det indre af kroppen. Forstyrrelse i kontinuiteten af denne barriere kan resultere i inflammatoriske lidelser som inflammatorisk tarmsygdom. En af begrænsningerne i studiet af tarmepitelebiologi har været manglen på primære cellekulturmodeller, som har tvunget forskere til at bruge modelcellelinjer afledt af carcinomer. Fremkomsten af tredimensionelle (3D) enteroider har givet epitelbiologer et kraftfuldt værktøj til at generere primære cellekulturer, ikke desto mindre er disse strukturer indlejret i ekstracellulær matrix og mangler den modenhed, der er karakteristisk for differentierede tarmepitele celler. Flere teknikker til at generere tarm epitel monolayers er blevet offentliggjort, men de fleste er afledt af etablerede 3D enteroids gør processen besværlig og dyr. Her beskriver vi en protokol til at generere primære epitel kolon monolag direkte fra murin tarm krypter. Vi beskriver også eksperimentelle tilgange, der kan bruges med denne model, såsom generering af sammenflydende kulturer på gennemtrængelige filtre, sammenløbet monolayer til ridsesårhelingsundersøgelser og sparsomme og sammenflydende monolayers til immunfluorescensanalyse.
Tarmepitele epitelceller (IEC) linje tarmene danner en selektivt gennemtrængelig barriere, der tillader næringsstof-og vandabsorption og samtidig forhindre mikroorganismer og toksiner at komme ind i kroppen 1. Tarmslimhinden består af luminale fremskrivninger kaldet villi (kun til stede i tyndtarmen) og invaginationer ved navn krypter. Villi og overfladen af kolonkrypter er dækket af differentierede epitelceller, mens bunden af krypterne består af stamceller, der gør den hurtige fornyelse af tarmepiteen, som har en omsætning fra 3 til 7 dage. Tarmstamceller (ISC) er ikke kun vigtige for at opretholde tarmhomøostase, men for tilstrækkelig reparation af beskadiget epithelia2.
Studiet af tarm-epitheliabiologien var begrænset af manglen på primære cellekulturer, hvor transformerede cellelinjer var det eneste tilgængelige værktøj. Tarm epitel model cellelinjer er ikke i stand til præcist at kopiere fysiologien af det normale tarmepitetel. Udviklingen af 3D-kulturer afledt af ISC gav tarmslimhindebiologer in vitro-modeller, der ligner in vivo tarmslimkosale forhold3. Krypter kan let isoleres fra murinprøver, indlejret i et kældermembranmatrixmedium (f.eks. Matrigel) og dyrkes i konditionerede medier, der indeholder Wnt3a, R-spondin og Noggin, der genererer 3D-strukturer kendt som enteroider (tyndtarmen) eller tyktarmsoider (tyktarm)4. Enteroider og koloider er polariserede sfæriske strukturer, hvor det apikale domæne står over for en intern lumen, og basolateralområdet er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrix. Enteroider og kolonoider indeholder alle større differentierede intestinale epitelundertyper som Enterocytter/Colonocytes, Paneth, Enteroendocrine og Goblet-celler, og de forekommer i relativt samme proportioner som i den del af tarmen, hvor de blev isoleret fra5. Selvom 3D-enteroider og kolonoider udgør et stort fremskridt i undersøgelsen af tarmudvikling og fysiologi, udgør disse modeller visse ulemper såsom begrænset adgang til den apikale overflade af epitelcellerne (lumen) og evnen til at skalere kulturer op eller ned for at opnå højgennemstrømningsscreening af molekyler af interesse. For at overvinde disse begrænsninger blev der genereret protokoller for at opnå primære 2D-kulturer i IEC afledt af 3D-enteroider / koloider. 2D enteroider / kolonoider vokse som ark celler ligesom model cellelinjer gør, og er ideelle til at studere tarm sår reparation, host-patogen interaktioner, og regenerativ medicin blandt andre. Flere offentliggjorte artikler beskriver, hvordan man genererer 2D monolayers fra 3D-strukturer eller direkte fra tarmkrypter (se6,7,8,9,10,11), men disse metoder har tendens til at være arbejdskrævende og svære at reproducere. En hurtig, enkel og reproducerbar metode til at opnå monolag direkte fra frisk isolerede muse tarmkrypter er skitseret i denne protokol.
Her forklarer vi i detaljer processen for kryptudvinding med minimal generering af snavs, ekstracellulært matrixvalg og forskellige overflader og applikationer til denne teknik. Denne eksperimentelle tilgang blev optimeret til kolonkrypter, men lignende resultater opnås, når de anvendes til tyndtarmen.
Vores protokol giver en hurtig, reproducerbar og pålidelig metode til at generere direkte primære 2D IEC monolayers. En af de vigtigste forskelle i vores protokol sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller til at generere kolon epitel monolayers er, at vi ikke skære tyktarmen i små stykker for at befri krypter. I stedet tilpassede vi en protokol til at adskille tarmepitelet fra mesenchym13 ved en kombination af kemiske og mekaniske kræfter til at frigive krypter i et ekstremt rent præparat , (Figur 2), hvilket giver forskeren ideelt materiale til at generere primære kulturer. Vores isolationsmetode kan også bruges til at generere 3D-enteroider og kolonoider. Det er vigtigt at gøre en krypt tælle hver gang et eksperiment udføres for at normalisere antallet af krypter, der bliver belagt. Variabler såsom kolon pølse turgor, hastighed af isolation, kan brugerekspertise påvirke antallet af krypterer isoleret. Den foreslåede plating kryptkoncentration, der er nævnt i protokollen, er et udgangspunkt, men enhver bruger, der skal tage højde for brugerdrevne variabler, skal optimere den. Vi har brugt denne teknik med mandlige og kvindelige WT-mus fra 8 til 20 uger, og vi har ikke set store forskelle i celleoverlevelse, i teorien har krypter isoleret fra yngre mus bedre chancer for at overleve. Krypter er belagt i overskud, da kun en lille procentdel af dem fastgøres til overfladen og overlever. En balance, hvor der er nok krypter til at have en 50% sammenløb en dag efter plating men ikke alt for mange krypter, hvor de døende krypter vil have en cytotoksisk effekt er målet. LWRN medier skal fjernes forsigtigt 24 timer efter plating at fjerne døde krypter og snavs, skal dette gøres omhyggeligt for at undgå at løsne celler, der allerede vokser som en monolayer.
Efter den første fjernelse af LWRN-medier skal brugeren beslutte, om forsøgsbetingelserne kræver primære IEC-monolag, der forbliver tættere på stamceller og tilføjer friske LWRN-medier, eller om der ønskes differentiering af monolayer, erstattes med differentieringsmedier. Den vigtigste faktor i denne protokol er at sikre kolonens integritet under isolationsprocessen. Hvis der opstår et brud, kan pølsen forkortes for at eliminere det beskadigede område. Før pølsen sættes i EDTA, skal du sørge for, at knuderne er så stramme som muligt. Hvis pølsen deflateres efter EDTA-inkubationen, kan protokollen fortsættes med ringe eller ingen effekt i det samlede kryptudbytte. Hvis den gentagne sprøjte ikke er tilgængelig, kan en almindelig mikropipettespids, der er fastgjort til en almindelig sprøjte, også bruges til inflations- og deflationsprocessen. Hvis der ikke findes en cellegendannelsesopløsning, kan inflations- og deflationstrinnene også udføres i EDTA (2mM tyndtarmen, 50 mM kolon), men denne substitution anbefales ikke. Hvis sammenløb ikke er påkrævet, kan krypter kun vokse i plader belagt med kollagen og endda i ubestrøget plader. Brug kun ubestrøget plader tilfælde er der ingen anden mulighed, men cellerne vil ikke vokse sundt, som de ville i kollagen-coatede plader. Når det kommer til kultur sundhed og stabilitet, monolayers belagt med plast er sunde i 4 til 5 dage, mens monolag belagt i transwells kan transporteres i op til 8 dage.
En af de vigtigste begrænsninger ved denne metode er de cellemedier, der kræves for at dyrke epitelkolonimonomererne. LWRN-celler er tilgængelige på ATCC, men LWRN-betinget mediegenerering er arbejdskrævende og kræver adgang til et fluorescerende spektrometer for at bestemme Wnt-aktivitet. Differentieringsmedier kræver en række reagenser, der tilsættes frisk før brug, hvilket gør det til en kedelig proces. Endelig er de fleste af disse reagenser dyre og er nemme at brænde reagenserne i et hurtigt tempo. Hvis et laboratorium ønsker at etablere denne teknik uden tidligere tarm primær celle kultur, anbefales det stærkt at finde en samarbejdspartner / college med erfaring og uddanne et af deres medlemmer.
Vedligeholdelse af 3D-kultur kan være dyrt på grund af omkostningerne ved kældermembranmatrix medium og store mængder konditionerede medier, der er nødvendige for organoidkulturer, men det har den fordel at bruge et reduceret antal mus, og de genererede strukturer kan passeres mange gange. Enteroider (afledt af tyndtarmen) er relativt nemme at isolere og vedligeholde, mens kolonoider er mere sarte, vokser i et langsommere tempo og har en mere begrænset passagekapacitet. Monolayer generation fra 3D-koloider kræver en uforholdsmæssig stor mængde af 3D-strukturer, der gør den slags eksperimenter tidskrævende og dyrt. Tværtimod, direkte epitel kolon monolayer prep er hurtig og er en hurtig måde at opnå resultaterne. Et kolon prep kan generere et sammenløbet område på 75 cm2 (10 til 15 mL konditioneret medier, erstatter en gang) 2 til 3 dage efter plating (dette område ville kræve 144 brønde af 3D-kolonoider, hvilket betyder næsten 6mL matrigel og mere end 250 mL konditioneret medier). Det lavere forbrug af medier, billig vedligeholdelse af cellekulturen og evnen til at udføre funktionelle tests og hurtig downstream-behandling er store fordele ved epitelkolonimonomerer.
Denne protokol er et værdifuldt værktøj i studiet af tarm epitelcellebiologi inden for områder som celle vedhæftning, polaritet og differentiering. Det giver den fordel at generere primære cellekulturer fra genetisk modificerede mus (knock-out, overexpressing, journalister). De primære tarmepitele monolayers giver nem adgang til de apikale og basolaterale overflader (når de er belagt på transwells), hvilket gør det muligt at studere permeabilitet, barriere og transepithelial migration af forskellige celletyper. Endelig kan denne model være nyttig på forskellige områder som værtspatogen interaktioner, epitelskader og reparation og lægemiddelopdagelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Crohns og Colitis Foundation Career Development Award (544599, til MQ) og NIH-stipendierne (DK055679, DK089763, DK059888, til AN). Vi vil gerne takke Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory for deres fortsatte hjælp og adgang til deres reagenser og protokoller.
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
Noggin | Conditioned media | – | |
Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |