इस प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि आंतों के क्रिप्ट्स से सीधे मुरीन प्राथमिक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर कैसे उत्पन्न करें। हम पारमीय फिल्टर पर कॉन्फ्ल्यूरेंट मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, खरोंच घाव भरने और जैव रासायनिक अध्ययनों के लिए कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए विरल और कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर।
आंतों के एपिथेलियम में कोशिकाओं की एक परत शामिल होती है जो आंत ल्यूमेन और शरीर के इंटीरियर के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करती है। इस बाधा की निरंतरता में व्यवधान के परिणामस्वरूप भड़काऊ आंत्र रोग जैसे भड़काऊ विकार हो सकते हैं। आंतों के एपिथेलियल जीव विज्ञान के अध्ययन में सीमाओं में से एक प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल की कमी रही है, जिसने शोधकर्ताओं को कार्सिनोमा से प्राप्त मॉडल सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए बाध्य किया है। तीन आयामी (3 डी) एंटरॉइड के आगमन ने एपिथेलियल जीवविज्ञानियों को प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण दिया है, फिर भी, ये संरचनाएं बाहकालीन मैट्रिक्स में एम्बेडेड हैं और विभेदित आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की परिपक्वता विशेषता की कमी है। आंतों के एपिथेलियल मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए कई तकनीकें प्रकाशित की गई हैं, लेकिन अधिकांश प्रक्रिया को श्रमसाध्य और महंगा बनाने वाले 3 डी एंटरॉइड से प्राप्त होते हैं। यहां हम मुरीन आंतों के तहखानों से सीधे प्राथमिक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का भी विस्तार करते हैं जिनका उपयोग इस मॉडल के साथ किया जा सकता है जैसे कि पारमीय फिल्टर पर कॉन्फ्ल्यूंट संस्कृतियों की पीढ़ी, खरोंच घाव भरने के अध्ययन के लिए एकाठ मोनोलेयर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए विरल और कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर।
आंतों की एपिथेलियल कोशिकाएं (आईईसी) आंतों को एक चुनिंदा पारमी बाधा बनाती हैं जो सूक्ष्मजीवों और विषाक्त पदार्थों को शरीर में प्रवेश करने से रोकते समय पोषक तत्व और पानी अवशोषण की अनुमति देती है 1। आंतों के म्यूकोसा चमकदार अनुमानों से बना है जिसे विली (केवल छोटी आंत में मौजूद) कहा जाता है और क्रिप्ट्स नाम के इनवेजिनेशन हैं। विली और कोलन क्रिप्ट्स की सतह विभेदित एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा कवर की जाती है जबकि क्रिप्ट्स के आधार में स्टेम सेल शामिल होते हैं जो आंतों के एपिथेलिया का तेजी से नवीकरण करते हैं, जिसका कारोबार 3 से 7 दिनों तक होता है। आंतों के स्टेम सेल (आईएससी) न केवल आंत होमोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं बल्कि क्षतिग्रस्त एपिथेलिया2की पर्याप्त मरम्मत के लिए हैं।
आंतों एपिथेलिया जीव विज्ञान का अध्ययन प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की कमी से सीमित था, जिसमें परिवर्तित सेल लाइनें एकमात्र उपकरण उपलब्ध थीं। आंतों के एपिथेलियल मॉडल सेल लाइनें सामान्य आंतों के एपिथेलियम के शरीर विज्ञान को सटीक रूप से दोहराने में सक्षम नहीं हैं। आईएससी से प्राप्त 3 डी संस्कृतियों के विकास ने आंतों के म्यूकोसल जीवविज्ञानियों को इन विट्रो मॉडल प्रदान किए जो वीवो आंत म्यूकोसलस्थितियोंमें समान हैं। क्रिप्ट्स को आसानी से मुरीन नमूनों से अलग किया जा सकता है, जो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम (जैसे, मैट्रिक्स) में एम्बेडेड होता है और वातानुकूलित मीडिया में उगाया जाता है जिसमें Wnt3a, आर-स्पॉन्डिन और नोगिन होते हैं, जो एंटोॉइड (छोटी आंत) या कोलोनॉइड (बड़ी आंत)4के रूप में जाना जाता है। एंटरॉइड और कोलोनॉइड ध्रुवीकृत गोलाकार संरचनाएं हैं जहां एपिकल डोमेन आंतरिक ल्यूमेन का सामना कर रहा है और बेसोटेरल क्षेत्र बाह्य मैट्रिक्स के सीधे संपर्क में है। एंटोइड्स और कोलोनॉइड में एंटोसाइट्स/कोलोनोसाइट्स, पैनेथ, एंटोएंडोक्राइन और गोबलेट कोशिकाओं जैसे सभी प्रमुख विभेदित आंतों के एपिथेलियल उप-प्रकार होते हैं और वे अपेक्षाकृत उसी अनुपात में दिखाई देते हैं जैसा कि वे आंत के खंड में करते हैं जहां वे5से अलग थे। हालांकि 3 डी एंटोलोइड और कोलोनॉइड आंतों के विकास और शरीर विज्ञान के अध्ययन में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करते हैं, ये मॉडल कुछ कमियां पेश करते हैं जैसे कि एपिथेलियल कोशिकाओं (ल्यूमेन) की एपिकल सतह तक सीमित पहुंच और रुचि के अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्राप्त करने के लिए संस्कृतियों को ऊपर या नीचे स्केल करने की क्षमता। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, 3 डी एंटोरॉयड/कोलोनॉइड से प्राप्त आईईसी की प्राथमिक 2डी संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल उत्पन्न किए गए थे । 2D एंटोरॉयड/कोलोनॉइड कोशिकाओं की शीट के रूप में बढ़ते हैं जैसे मॉडल सेल लाइनें करते हैं और आंतों के घाव की मरम्मत, मेजबान-रोगजनक बातचीत और अन्य लोगों के बीच पुनर्योजी दवा का अध्ययन करने के लिए आदर्श होते हैं। कई प्रकाशित पत्रों में बताया गया है कि 3डी संरचनाओं से या सीधे आंतों के क्रिप्ट्स से 2D मोनोलेयर कैसे उत्पन्न करें,(देखें 6,7,8,9,10,11)लेकिन ये विधियां श्रम गहन और पुन: पेश करने के लिए कठिन होती हैं। हौसले से अलग माउस आंतों के क्रिप्ट्स से सीधे मोनोलेयर्स प्राप्त करने के लिए एक तेज, सरल और प्रजनन योग्य विधि इस प्रोटोकॉल में रेखांकित की गई है।
यहां हम मलबे की न्यूनतम पीढ़ी, बाहुलीय मैट्रिक्स विकल्प और इस तकनीक के लिए विभिन्न सतहों और अनुप्रयोगों के साथ क्रिप्ट निष्कर्षण की प्रक्रिया को विस्तार से समझाते हैं। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को कोलन क्रिप्ट्स के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन छोटी आंत के लिए लागू होने पर इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए जाते हैं।
हमारा प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष प्राथमिक 2D आईईसी मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक तेज़, प्रजनन योग्य और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है। पेट एपिथेलियल मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में हमारे प्रोटोकॉल में मुख्य अंतर में से एक यह है कि हम क्रिप्ट्स को मुक्त करने के लिए पेट को छोटे टुकड़ों में नहीं काटते हैं। इसके बजाय, हमने एक बेहद साफ तैयारी में क्रिप्ट्स को रिलीज करने के लिए रासायनिक और यांत्रिक बलों के संयोजन द्वारा मेसेंचिम13 से आंतों के एपिथेलियम को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित किया,(चित्र 2),शोधकर्ता को प्राथमिक संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए आदर्श सामग्री प्रदान करता है। हमारे अलगाव विधि का उपयोग 3डी एंटरनोइड और कोलोनॉइड उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है। हर बार क्रिप्टो किए जा रहे क्रिप्ट्स की संख्या को सामान्य बनाने के लिए एक प्रयोग किया जाता है तो क्रिप्ट काउंट करना महत्वपूर्ण है। कोलन सॉसेज टर्गर, अलगाव की गति, उपयोगकर्ता विशेषज्ञता जैसे चर अलग-थलग क्रिप्टो की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं। प्रोटोकॉल में उल्लिखित सुझाए गए प्लेटिंग क्रिप्ट एकाग्रता एक प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन उपयोगकर्ता संचालित चरों के लिए खाते में प्रत्येक उपयोगकर्ता को इसे अनुकूलित करना चाहिए। हम पुरुष और महिला WT 8 से 20 सप्ताह से लेकर चूहों के साथ इस तकनीक का इस्तेमाल किया है और हम सेल अस्तित्व में प्रमुख अंतर नहीं देखा है, सिद्धांत में युवा चूहों से अलग तहखाने में जीवित रहने के लिए बेहतर संभावना है । क्रिप्ट्स को अतिरिक्त रूप से चढ़ाया जाता है क्योंकि उनमें से केवल एक छोटा प्रतिशत सतह से जुड़ता है और जीवित रहता है। एक संतुलन जहां चढ़ाना के बाद एक दिन 50% संकुचन के लिए पर्याप्त क्रिप्ट हैं, लेकिन बहुत सारे क्रिप्ट नहीं हैं जहां मरने वाले क्रिप्ट्स का साइटोटॉक्सिक प्रभाव होगा लक्ष्य है। LWRN मीडिया ध्यान से मृत तहखाने और मलबे को खत्म करने के लिए चढ़ाना के बाद 24 घंटे हटा दिया जाना चाहिए, यह ध्यान से किया जाना चाहिए कोशिकाओं है कि पहले से ही एक मोनोलेयर के रूप में बढ़ रहे है अलग से बचने के लिए ।
LWRN मीडिया के प्रारंभिक हटाने के बाद, उपयोगकर्ता को यह तय करना होगा कि प्रायोगिक स्थितियों को प्राथमिक आईईसी मोनोलेयर की आवश्यकता होती है जो स्टेम सेल के करीब रहते हैं और ताजा एलडब्ल्यूआरएन मीडिया जोड़ते हैं या यदि मोनोलेयर का भेदभाव वांछित है, तो भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। इस प्रोटोकॉल में एक सबसे महत्वपूर्ण कारक अलगाव प्रक्रिया के दौरान पेट की अखंडता को आश्वस्त करना है। यदि टूटना होता है, तो क्षतिग्रस्त क्षेत्र को खत्म करने के लिए सॉसेज को छोटा किया जा सकता है। EDTA में सॉसेज डालने से पहले सुनिश्चित करें कि समुद्री मील जितना संभव हो उतना तंग कर रहे हैं। यदि EDTA इनक्यूबेशन के बाद सॉसेज को हवा निकाल दिया जाता है तो समग्र तहखाना उपज में कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। यदि रिपीट सिरिंज उपलब्ध नहीं है, तो नियमित सिरिंज से जुड़ी एक नियमित माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग मुद्रास्फीति और अपस्फीति की प्रक्रिया के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि कोई सेल रिकवरी समाधान उपलब्ध नहीं है, तो ईडीटीए (2mM छोटी आंत, 50 mm कोलन) में मुद्रास्फीति और अपस्फीति कदम किए जा सकते हैं, लेकिन इस प्रतिस्थापन की सिफारिश नहीं की जाती है। यदि कन्फ्लेमनी की आवश्यकता नहीं है, तो क्रिप्ट केवल कोलेजन के साथ और यहां तक कि अनकोटेड प्लेटों में लेपित प्लेटों में विकसित हो सकते हैं। केवल अनकोटेड प्लेटों के मामलों का उपयोग करें कोई अन्य विकल्प नहीं है, लेकिन कोशिकाएं स्वस्थ नहीं होंगी क्योंकि वे कोलेजन-लेपित प्लेटों में होंगी। जब संस्कृति स्वास्थ्य और स्थिरता की बात आती है, तो प्लास्टिक में चढ़ाए गए मोनोलेयर 4 से 5 दिनों तक स्वस्थ होते हैं जबकि ट्रांसवेल में चढ़ाए गए मोनोलेयर को 8 दिनों तक ले जाया जा सकता है।
इस विधि की मुख्य सीमाओं में से एक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर विकसित करने के लिए आवश्यक सेल मीडिया है। LWRN कोशिकाओं एटीसीसी में उपलब्ध हैं, लेकिन LWRN वातानुकूलित मीडिया पीढ़ी श्रम गहन है और Wnt गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोमीटर के लिए उपयोग की आवश्यकता है । विभेदन मीडिया को कई अभिकर्त्रों की आवश्यकता होती है जिन्हें उपयोग से पहले ताजा जोड़ा जाता है, जो इसे एक थकाऊ प्रक्रिया बनाता है। अंत में इनमें से ज्यादातर रिएजेंट्स महंगे होते हैं और रिएजेंट्स को तेज रफ्तार में जलाने में आसानी होती है। यदि एक प्रयोगशाला पिछले आंतों प्राथमिक सेल संस्कृति के बिना इस तकनीक को स्थापित करने की इच्छा है, यह अत्यधिक अनुभव के साथ एक सहयोगी/कॉलेज खोजने के लिए और उनके सदस्यों में से एक को प्रशिक्षित करने की सिफारिश की है ।
3 डी संस्कृति का रखरखाव बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम की लागत और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए आवश्यक वातानुकूलित मीडिया की उच्च मात्रा के कारण महंगा हो सकता है, लेकिन इसमें चूहों की कम संख्या का उपयोग करने का लाभ है और उत्पन्न संरचनाओं को कई बार पारित किया जा सकता है। एंटरॉइड (छोटी आंत से प्राप्त) को अलग करना और बनाए रखना अपेक्षाकृत आसान है जबकि कोलोनोइड अधिक नाजुक होते हैं, धीमी गति से बढ़ते हैं और अधिक सीमित मार्ग क्षमता रखते हैं। 3 डी कोलोनॉइड से मोनोलेयर पीढ़ी को 3 डी संरचनाओं की आय से अधिक राशि की आवश्यकता होती है, जो इस प्रकार के प्रयोगों को समय लेने और महंगा बनाती है। इसके विपरीत, प्रत्यक्ष एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर प्रेप तेज है और परिणाम प्राप्त करने का एक त्वरित तरीका है। एक कोलन प्रेप 75 सेमी2 (वातानुकूलित मीडिया के 10 से 15 एमएल) का एक ढुलमुल क्षेत्र उत्पन्न कर सकता है, एक बार बदलता है) चढ़ाना के बाद 2 से 3 दिन (इस क्षेत्र को 3 डी कोलोनॉइड के 144 कुओं की आवश्यकता होगी, जिसका अर्थ है लगभग 6mL Matrigel और 250 एमएल से अधिक वातानुकूलित मीडिया)। मीडिया की कम खपत, सेल संस्कृति का कम लागत रखरखाव और कार्यात्मक परीक्षण ों और तेजी से डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण करने की क्षमता एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर के बड़े फायदे हैं।
यह प्रोटोकॉल सेल-आसंजन, ध्रुवता और भेदभाव जैसे क्षेत्रों में आंतों के एपिथेलियल सेल जीव विज्ञान के अध्ययन में एक मूल्यवान उपकरण है। यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों (नॉक-आउट, ओवरएक्सप्रेसिंग, रिपोर्टर्स) से प्राथमिक सेल संस्कृतियों को उत्पन्न करने का लाभ देता है। प्राथमिक आंतों के एपिथेलियल मोनोलेयर विभिन्न कोशिकाओं प्रकारों के पारगम्यता, बाधा और ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन के अध्ययन की अनुमति देते हैं। अंत में, यह मॉडल मेजबान-रोगजनकों की बातचीत, एपिथेलियल क्षति और मरम्मत और दवा की खोज जैसे विभिन्न क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को क्रोन और कोलाइटिस फाउंडेशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (544599, एमक्यू को) और एनआईएच ग्रांट (DK055679, DK089763, DK0598888, AN) द्वारा समर्थित किया गया था। हम उनकी निरंतर मदद और उनके अभिकर् में और प्रोटोकॉल के लिए उपयोग के लिए मिशिगन मेडिसिन ट्रांसलेशनल ऊतक मॉडलिंग प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
Noggin | Conditioned media | – | |
Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |