Syftet med detta protokoll är att använda levande imaging för att visualisera effekterna av oxidativ skada på lokalisering och dynamik av subcellulära strukturer i Drosophila äggstockar.
Live imaging av Drosophila melanogaster äggstockar har varit avgörande för att förstå en mängd grundläggande cellulära processer under utveckling, inklusive ribonukleoprotein partikelrörelse, mRNA lokalisering, organelle rörelse och cytoskeletal dynamik. Det finns flera metoder för live imaging som har utvecklats. På grund av det faktum att varje metod innebär dissekering av enskilda ovarioler placerade i media eller halokarbonolja, kommer cellulära skador på grund av hypoxi och/eller fysisk manipulering oundvikligen att uppstå med tiden. En nedströms effekt av hypoxi är att öka oxidativ skada i cellerna. Syftet med detta protokoll är att använda levande imaging för att visualisera effekterna av oxidativ skada på lokalisering och dynamik av subcellulära strukturer i Drosophila äggstockar efter induktion av kontrollerade cellulära skador. Här använder vi väteperoxid för att inducera cellulära oxidativa skador och ge exempel på effekterna av sådana skador på två subcellulära strukturer, mitokondrier och Clu-lycksalighetspartiklar. Denna metod är dock tillämplig på alla subcellulära strukturer. Begränsningarna är att väteperoxid endast kan tillsättas vattenhaltiga medier och inte skulle fungera för avbildning som använder halokarbonolja. Fördelarna är att väteperoxid är lättillgängligt och billigt, verkar snabbt, dess koncentrationer kan moduleras och oxidativ skada är en bra approximation av skador orsakade av hypoxi samt allmän vävnadsskada på grund av manipulering.
Flera olika cellulära stressfaktorer kan uppstå under experimentell kultur och manipulering av vävnader ex vivo, inklusive värmechock, oxidativ stress, osmotisk stress, näringsstress och toxicitetsförhållanden. Live imaging är ett kraftfullt verktyg som används för att visualisera realtidsförändringar i ex vivo-vävnader efter experimentell behandling och manipulering. Fina vävnadsavvektioner och manipulering övar, och tiden från dissekering till avbildning kan variera beroende på erfarenhet. Motiveringen för att utveckla denna metod bygger på oron för att beredning av vävnad för levande avbildning kan orsaka cellulär stress under dissekering och bildberedning. Detta kan vara särskilt problematiskt för processer som är känsliga för förändringar i cellulär metabolism och tillgängliga syrenivåer, såsom mitokondriell funktion. Även om ett parallellt vildtypsprov är en viktig kontroll, finns det fortfarande möjlighet att vissa eller alla observerade förändringar i subcellulära strukturer kan bero på skador eller cellstress från dissekering och inte återspeglar normal fysiologi eller den behandling eller mutation som studeras.
För att ta itu med detta potentiella problem använder vi väteperoxid addition under levande avbildning för att inducera cellulära oxidativ skada1. Syftet med denna metod är att inducera skador på vävnader för att övervaka effekten på subcellulära strukturer. Detta protokoll är användbart för två ändamål: 1) att avgöra om förändringar i subcellulär lokalisering av intressestrukturen beror på den stress som orsakas av oerfaren dissekering och 2) när forskaren är säker på de dissektionstekniker som beskrivs för att övervaka effekten av kontrollerad stress på intressestrukturen. Här visar vi två exempel på hur ökad oxidativ skada orsakar förändringar i två subcellulära strukturer, mitokondrier och Clu lycksalighetspartiklar. För att göra detta använder vi Drosophila äggstocken som är en vanlig modell för live imaging studier. Det första exemplet undersöker mitokondriell lokalisering. Enligt vår erfarenhet är normal mitokondriell lokalisering i kvinnliga könsceller mycket känslig för belastningar och kan fungera som en harbinger av cellulär stress. Mitokondrier i Drosophila kvinnliga könsceller är normalt jämnt spridda över hela cytoplasman2. Väteperoxid tillägg orsakar organellerna att snabbt fellokalisera och kluster på liknande sätt som olika mutationer3,4,5. Det andra exemplet är lycksaliga partiklar som bildas av Clueless (Clu). Clu är ett ribonukleoprotein som är diffust i hela cytoplasman; emellertid bildar det också mitokondrier-associerade partiklar under optimala cellulära förhållanden5. Eftersom närvaron av Clu-partiklar är beroende av friska cellulära förhållanden, har vi termerat dem “salighet” partiklar3,5,6. Tillsats av väteperoxid gör att dessa partiklar snabbt sprids och blir homogena i cytoplasman5. Under våra studier har vi observerat förändringar i lokalisering av båda dessa subcellulära strukturer, men först efter att ha utfört levande bildstudier kunde vi fullt ut uppskatta effekten av cellulär stress och oxidativ skada på lokalisering och dynamik av mitokondrier och salighetspartiklar.
Nyttan av detta protokoll som ett tillägg till redan etablerade eller alternativa metoder beror på flera faktorer. För det första måste avbildningsprotokollet vara mottagligt för läkemedelstillskott. Om provet är monterat under ett locklip och i halokarbonolja skulle denna metod inte vara möjlig7. H2O2 tillägg orsakar en snabb ökning av oxidativ skada, därför kanske denna tidsskala inte är lämplig. Oxidativ skada kan betraktas som en proxy för hypoxi; Det kan dock vara för hårt eller för generaliserat för att fungera som en lämplig kontroll för skador för vissa subcellulära komponenter. Slutligen, för bildexperiment som varar timmar som de som följer en utvecklingsprocess, kan H2O2-tillägget vara för starkt (till exempel8). Testning av en koncentrationskurva kan övervinna denna begränsning.
Detta protokoll kan vara ett användbart tillägg som en kontroll för artefakter på grund av äggstocksavledning och vävnad inkubation för alla levande imaging experiment. De kritiska stegen liknar de som finns för andra live imaging-protokoll. Att lära sig att dissekera hela Drosophila äggstockar kräver övning; Denna färdighet kan dock vanligtvis läras ganska snabbt med lämpliga dissektionsverktyg. Svårare att behärska är att ta bort muskeln som omsluter äggstockarna och varje ovariol13. Detta måste göras för att säkerställa att muskelkontraktioner inte stör bildförvärvet. Om det inte visar sig framgångsrikt att använda slipade volframnålar för att göra detta, kan pelargonen vid ovariolspetsen gripas med tång och ovariolen dras från muskelsenan. Denna teknik är dock problematisk om de tidigaste utvecklingsstadierna ska undersökas eftersom de kan skadas. Ett annat viktigt steg är att inte lossa ovariolerna som vilar på botten av skålen när du lägger till H2O2. En annan viktig aspekt delas av all live imaging: forskaren bör se till att intressestrukturen är fluorescerande välmärkt före behandling. De rätter som används här (Table of Materials) används ofta för live imaging; Varje skål eller rutschkana med ett glaslock på botten eller till och med ett stort glaslock bör dock fungera så länge mediedroppe kan täckas för att förhindra avdunstning av media. Medan vi använder ett visst mikroskop bör alla inverterade mikroskop med ett mål om tillräcklig förstoring för att se den subcellulära strukturen i fråga och en ansluten kamera som har tillräcklig upplösning och bildinspelningshastighet fungera.
Medan vårt laboratorium främst är intresserade av mitokondriell funktion, kan denna metod vara till hjälp undersöka dynamiken och lokaliseringen av någon subcellulär struktur eller organell, såsom kärnan, cytoskeletonen eller endoplasma retikulum. Denna metod har dock begränsningar. För att tillsätta väteperoxid måste vävnaden vara i ett vattenhaltigt medium. En alternativ metod för levande avbildning är att använda halokarbonolja, som har varit avgörande för att beskriva många viktiga processer i Drosophila ovarioles inklusive det första exemplet på dynamisk rörelse av GFP i en modellorganism7,14. Dessutom orsakar tillsats av väteperoxid till media omfattande oxidativ skada som kan vara en alltför allmän förolämpning mot vävnaden för att vara informativ för den cellulära processen av intresse, särskilt för längre experiment som undersöker utveckling. Även om det kanske inte är möjligt att utföra experiment som kräver visualisering av cellen under långa tidsperioder på grund av denna snabba, omfattande och sannolikt irreversibla oxidativa skada, har vi sett att den akuta väteperoxidbehandlingen vi har beskrivit är tillämplig på de flesta stadier av oogenes eftersom vi kan se samma effekter i de flesta steg inom bildperioden. Med tanke på protokollets låga kostnad och lätthet kan det vara en användbar kontroll för skador och kan också användas som behandling före fixering och antikroppsmärkning.
I våra händer efterliknar H2O2 behandling förändringarna i mitokondriell fellokalisering och Clu bliss partikel dispersion som vi ser i olika Drosophila mutanter. Det efterliknar också resultat som vi ser för nya forskare i labbinlärningsdisektionstekniken. Därför visade denna metod tydligt att provberedning och allmän cellulär stress kan leda till oväntade och tidigare oförklarliga förändringar av mitokondriell fellokalisering och förekomsten av lycksalighetspartiklar. För att föra denna teknik framåt kan väteperoxidkoncentrationer moduleras med en högre eller lägre koncentration. Om en cellulär effekt ses med en lägre koncentration är det möjligt att stress fenotypen kan vara reversibel genom att ersätta mediet med Complete Schneiders. Olika cellstressfaktorer som karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), arsenit eller enkel värmechock kan visa sig vara användbara för allmän cellulär stress för andra subcellulära strukturer. Eftersom levande avbildning av ex vivo vävnader kräver manuell manipulering och inkubation i olika medier, bör denna kontroll vara ett användbart tillägg för att säkerställa att eventuella observationer är så nära normal fysiologi som möjligt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Jeremy Smyth för bildstöd och Ann C. Shenk för illustrationer, produktion och videografi. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (1R01GM127938 till R.T.C.).
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |