Nous avons développé un protocole généralisé pour dissocier une grande quantité de cellules simples de haute qualité de l’épithélium et du mesenchyme/tissu conjonctif des langues embryonnaires et adultes de souris.
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Article de méthode
Dissociation cellulaire de l’épithélium de la langue et du mesenchyme/tissu conjonctif des souris embryonnaires de 12,5 et de 8 semaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dissociation cellulaire a été une procédure essentielle pour les études au niveau de chaque cellule et/ou au niveau de la population cellulaire (p. ex. séquençage de l’ARN unicellulaire et culture cellulaire primaire). Il est essentiel de produire des cellules viables et saines en grande quantité, et les conditions optimales pour le faire dépendent des tissus. Les populations cellulaires dans l’épithélium de la langue et le mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacent sont hétérogènes et les structures tissulaires varient selon les régions et à différents stades de développement. Nous avons testé des protocoles pour isoler des cellules de l’épithélium de langue de souris et du mesenchyme/tissu conjonctif aux stades de développement précoce [jour embryonnaire 12.5 (E12.5)] et de jeune adulte (8 semaines). Une séparation propre entre l’épithélium et le mesenchyme/tissu conjonctif fondamentaux était facile à accomplir. Cependant, pour traiter et isoler davantage les cellules, il est essentiel de produire des cellules saines viables en grande quantité et de sélectionner soigneusement le tampon de digestion enzymatique, le temps d’incubation et la vitesse et le temps de centrifugation. L’incubation de l’épithélium séparé ou du mésenchyme/tissu conjonctif sous-jacent dans 0,25 % de Trypsine-EDTA pendant 30 min à 37 °C, suivie d’une centrifugation à 200 x g pendant 8 min a donné un rendement élevé de cellules à un taux de viabilité élevé (>90 %) quels que soient les stades de la souris et les régions de la langue. D’ailleurs, nous avons constaté que les cellules épithéliales dissociées et mesenchymal/conjonctif de tissu des langues embryonnaires et adultes pourraient survivre dans le milieu basé sur la culture cellulaire pendant au moins 3 h sans diminution significative de viabilité cellulaire. Les protocoles seront utiles pour les études qui nécessitent la préparation de cellules isolées à partir de langues de souris à des stades de développement précoce (E12.5) et de jeune adulte (8 semaines) nécessitant une dissociation cellulaire de différents compartiments tissulaires.
Introduction
La langue des mammifères est un organe complexe essentiel pour le goût, la parole et la transformation des aliments. Il est composé de plusieurs types de tissus fortement organisés compartimentés par le mesenchyme/tissu conjonctif et recouverts d’une feuille épithéliale stratifiée contenant des papilles gustatives et des papilles gustatives. Les populations de cellules dans l’épithélium de langue et le mesenchyme/tissu conjonctif sont hétérogènes. Pour mieux comprendre les fonctions et la distribution d’un type particulier de cellules dans la langue, des études utilisant des cellules dissociées sont nécessaires. Par exemple, le séquençage de l’ARN unicellulaire est un....
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Protocole
L’utilisation d’animaux (souris C57BL/6 tout au long de l’étude) a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie et était conforme aux lignes directrices des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux à des fins de recherche.
1. Utilisation des animaux
REMARQUE: Les souris ont été élevées et maintenues dans l’installation animale du département des sciences animales et laitières de l’Université de Géorgie à 22 ° C sous des cycles jour / nuit de 12 h.
- Désigner midi du jour de la détection des bouchons vaginaux ch....
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Résultats
Séparation de l’épithélium de langue du mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacent
Dans la langue embryonnaire de souris, un espace dans l’espace sous-épithélial est visible après une digestion enzymatique appropriée. Les feuilles épithéliales de certaines langues sont séparées sans force mécanique pendant l’incubation.
Dans la langue de souris adulte, une injection d’enzymes réussie est indiquée par le gonflement dans les zones injectées (Figure 1B
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Discussion
Jusqu’ici, il n’y a pas eu de protocole détaillé disponible pour la dissociation de cellules de l’épithélium de langue et du mesenchyme/tissu conjonctif fondamentaux. Ce protocole actuel de dissociation cellulaire fournit une procédure reproductible pour générer une suspension cellulaire unique avec une viabilité cellulaire élevée (>90%) des tissus de langue de souris, y compris les feuilles épithéliales et les tissus mésenchymes/conjonctifs aux stades embryonnaire et postnatal, même si les cellules isolées d’E12,5 et de.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health, sous les numéros de subvention R01DC012308 et R21DC018089 à HXL. Nous remercions Brett Marshall (Université de Géorgie, Athènes, GA) et Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) pour l’assistance technique et la consultation concernant la dissociation cellulaire; à Francisca Gibson Burnley (Université de Géorgie, Athènes, GA) pour l’édition anglaise.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| albumine sérique bovine (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| souris C57BL/6 (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| la collagénase (Collagénase A) | 10103586001 | Sigma-Aldrich | |
| (35 mm de diamètre) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| (100 mm de diamètre) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| (Student Fine Scissors) | Trouver un outil scientifique | 91460-11 | |
| DMEM/F12 Gibco | 11320033 | ||
| sérum fœtal bovin (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| pince fine (Dumount #3 Forceps) | Trouver un outil scientifique | 11293-00 | |
| hémocytomètre | Hausser Scientific | 3520 | |
| microscope inversé avec système d’imagerie (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| pointes de pipette à faible rétention | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| (ciseaux à ressort Evo) | Outil de science fine | 15800-01 | |
| chaîne en plastique | VWR | 46610-056 | |
| spatule (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| pince chirurgicale (Dumount #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode' s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | à base de sels de Tyrode |
| 0,25 % de typsine-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Hoefer | 33946 | à partir de 1 M de PBS |
| 0,22-&mu ; Filtre à seringue | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70 % d’éthanol | Koptec | 233919 | à 100 % d’éthanol |
| Seringue de 1 mL | BD | 8194938 | |
| tube de microcentrifugation à faible liaison de 5 mL | Eppendorf | 30122348 | |
| aiguille de 30 G | BD | 9193532 | |
| 35-&mu ; crépine à cellules m | Falcon | 64750 | |
| 70-&mu ; crépine à cellules m | Falcon | 64752 |
Références
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
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Réimpressions et autorisations
