Celledissosiasjon fra tungeepitelet og mesenchyme/bindevev av embryonale dager 12,5 og 8 uker gamle mus
Summary
Vi har utviklet en generalisert protokoll for å dissosiere en stor mengde høykvalitets enkeltceller fra epitelet og mesenchyme / bindevev av embryonale og voksne musetunger.
Abstract
Celledissosiasjon har vært en viktig prosedyre for studier på individcellenivå og/eller på cellepopulasjonsnivå (f.eks. enkeltcellet RNA-sekvensering og primærcellekultur). Å gi levedyktige, sunne celler i store mengder er kritisk, og de optimale forholdene for å gjøre det er vevsavhengige. Cellepopulasjoner i tungeepitelet og underliggende mesenchyme/bindevev er heterogene og vevsstrukturer varierer i forskjellige regioner og i ulike utviklingsstadier. Vi har testet protokoller for å isolere celler fra musetunge epitel og mesenchyme/bindevev i de tidlige utviklingsstadiene [embryonal dag 12,5 (E12,5)] og ung voksen (8 uker). En ren separasjon mellom epitelet og underliggende mesenchyme/bindevev var lett å oppnå. Men for å viderebehandle og isolere celler, gi levedyktige sunne celler i store mengder, og nøye utvalg av enzymatisk fordøyelsesbuffer, inkubasjonstid og sentrifugeringshastighet og tid er avgjørende. Inkubasjon av separert epitel eller underliggende mesenchyme/bindevev i 0,25% Trypsin-EDTA i 30 min ved 37 °C, etterfulgt av sentrifugering ved 200 x g i 8 minutter resulterte i et høyt utbytte av celler med høy levedyktighetsgrad (>90%) uavhengig av musestadiene og tungeområdene. Videre fant vi at både dissosierte epitelceller og mesenchymale/bindevevsceller fra embryonale og voksne tunger kunne overleve i det cellekulturbaserte mediet i minst 3 timer uten en betydelig reduksjon av celle levedyktighet. Protokollene vil være nyttige for studier som krever fremstilling av isolerte celler fra musetunger ved tidlig utvikling (E12.5) og unge voksne (8-ukers) stadier som krever celledissosiasjon fra forskjellige vevsrom.
Introduction
Pattedyrspråket er et komplekst organ som er kritisk for smak, tale og matbehandling. Den består av flere typer høyt organisert vev inndelt av mesenchyme / bindevev og dekket av et stratifisert epitelplate som inneholder smak papiller og smaksløker. Cellepopulasjoner i både tungeepitelet og mesenchyme/bindevev er heterogene. For bedre å forstå funksjonene og fordelingen av en bestemt type celler i tungen, er det nødvendig med studier ved hjelp av dissosierte celler. For eksempel er enkeltcellet RNA-sekvensering en kraftig og høy gjennomstrømningsmetode for transkripsjonsprofilering i individuelle celler, som er utformet for å forstå transkripsjonen av komplekst vev med en enkeltcellet oppløsning1,2,3,4. Primærcellekultur har vist seg å være et nyttig verktøy for å studere funksjonen og differensiering av stamceller for smaksløker5,6. Disse studiene krever en stor mengde isolerte cellepopulasjoner av høy kvalitet (f.eks. tilstrekkelig totalt cellenummer med riktig konsentrasjon og høy levedyktighet).
Dermed er det behov for å isolere celler fra forskjellige regioner i det linguale vevet og på forskjellige utviklingsstadier. For tiden er det ikke en detaljert protokoll tilgjengelig for celledissosiasjon fra tungeepitelet og underliggende mesenchyme / bindevev. Her rapporterer vi en optimalisert celledissosiasjonsmetode for å forberede celler for eksperimenter som krever høy kvalitet på levende celler som for enkeltcellet RNA-sekvensering og primære stamcellekulturer. Vi fant at valg av enzymatisk fordøyelsesbuffer, skånsom pipettering, valg av resuspensasjonsmedium og optimal sentrifugeringstid og hastighet er avgjørende for å generere disse store mengdene av celler av høy kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til dags dato har det ikke vært en detaljert protokoll tilgjengelig for celledissosiasjon fra tungeepitelet og underliggende mesenchyme / bindevev. Denne gjeldende celledissosiasjonsprotokollen inneholder en reproduserbar prosedyre for å generere en enkelt cellesuspensjon med høy celle levedyktighet (>90 %) fra musetungevev, inkludert epitelplater og mesenchyme/bindevev i både embryonale og postnatale stadier, selv om isolerte celler fra E12,5 og voksne mus er forskjellige i størrelse. For eksempel er isolerte celle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Institutes of Health, tilskuddsnummer R01DC012308 og R21DC018089 til HXL. Vi takker Brett Marshall (University of Georgia, Athen, GA) og Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) for teknisk assistanse og konsultasjon angående celledissosiasjon; til Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athen, GA) for engelsk redigering.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
