Denne protokollen illustrerer et kjemisk indusert protein dimeriseringssystem for å skape kondensater på kromatin. Dannelsen av promyelocytisk leukemi (PML) kjernelegeme på telomerer med kjemiske dimerizere er demonstrert. Dråpevekst, oppløsning, lokalisering og sammensetning overvåkes med levende celleavbildning, immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Kromatin-assosierte kondensater er involvert i mange kjernefysiske prosesser, men de underliggende mekanismene forblir unnvikende. Denne protokollen beskriver et kjemisk indusert protein dimeriseringssystem for å skape kondensater på telomerer. Den kjemiske dimmerizeren består av to koblede ligander som hver kan binde seg til et protein: Halo ligand til Halo-enzymet og trimetoprim (TMP) til henholdsvis E. coli dihydrofolate reduktase (eDHFR). Fusjon av Halo-enzymet til et telomerprotein forankrer dimerizers til telomerer gjennom kovalent Halo ligand-enzymbinding. Binding av TMP til eDHFR rekrutterer eDHFR-smeltet fase som skiller proteiner til telomerer og induserer kondensatdannelse. Fordi TMP-eDHFR-interaksjon ikke er kovalent, kan kondens reverseres ved å bruke overflødig fri TMP til å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding. Et eksempel på å indusere promyelocytisk leukemi (PML) kjernefysisk kroppsdannelse på telomerer og bestemme kondensatvekst, oppløsning, lokalisering og sammensetning er vist. Denne metoden kan enkelt tilpasses for å indusere kondensater på andre genomiske steder ved å fusjonere Halo til et protein som direkte binder seg til det lokale kromatinet eller til dCas9 som er rettet mot det genomiske locus med en guide RNA. Ved å tilby den tidsmessige oppløsningen som kreves for encellet levende avbildning samtidig som faseseparasjon opprettholdes i en populasjon av celler for biokjemiske analyser, er denne metoden egnet for å undersøke både dannelsen og funksjonen til kromatinrelaterte kondensater.
Mange proteiner og nukleinsyrer gjennomgår væske-væske fase separasjon (LLPS) og selvmontering i biomolekylære kondensater for å organisere biokjemi i celle1,2. LLPS av kromatinbindende proteiner fører til dannelse av kondensater som er forbundet med spesifikk genomisk loci og er involvert i ulike lokale kromatinfunksjoner3. For eksempel ligger LLPS av HP1-protein til grunn for dannelsen av heterokromatindomener for å organisere genomet4,5, LLPS av transkripsjonsfaktorer danner transkripsjonssentre for å regulere transkripsjon6, LLPS av nascent mRNAer og multi-sex kammer protein genererer histone locus organer for å regulere transkripsjon og behandling av histone mRNAs7. Til tross for mange eksempler på kromatinrelaterte kondensater som oppdages, forblir de underliggende mekanismene for kondensatdannelse, regulering og funksjon dårlig forstått. Spesielt dannes ikke alle kromatinrelaterte kondensater gjennom LLPS, og nøye evalueringer av kondensatdannelse i levende celler er fortsatt nødvendig8,9. For eksempel er HP1-protein i mus vist å ha bare en svak kapasitet til å danne flytende dråper i levende celler og heterokromatinfoci oppfører seg som kollapset polymer globules10. Derfor er verktøy for å indusere de novokondensater på kromatin i levende celler ønskelige, spesielt de som tillater bruk av levende avbildning og biokjemiske analyser for å overvåke kinetikken til kondensatdannelse, de fysiske og kjemiske egenskapene til de resulterende kondensatene og de cellulære konsekvensene av kondensatdannelse.
Denne protokollen rapporterer et kjemisk dimeriseringssystem for å indusere proteinkondensater på kromatin11 (figur 1A). Dimerizer består av to koblede proteininteragerende ligander: trimetoprim (TMP) og Halo ligand og kan dimerisere proteiner smeltet til konjakkreseptorene: Escherichia coli dihydrofolate reduktase (eDHFR) og et bakterielt alkyldehalogenase enzym (Halo enzyme), henholdsvis12. Samspillet mellom Halo ligand og Halo-enzymet er kovalent, slik at Halo-enzymet kan brukes som anker ved å smelte det sammen til et kromatinbindende protein for å rekruttere et faseseparerende protein smeltet til eDHFR til kromatin. Etter den første rekrutteringen passerer økt lokal konsentrasjon av faseseparasjonsproteinet den kritiske konsentrasjonen som trengs for faseseparasjon og nukleerer dermed et kondensat ved ankeret (figur 1B). Ved å fusjonere fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry og eGFP) til eDHFR og Halo, kan kjernedannelse og vekst av kondensater visualiseres i sanntid med fluorescensmikroskopi. Fordi samspillet mellom eDHFR og TMP ikke er kovalent, kan overflødig fri TMP legges til for å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding. Dette vil deretter frigjøre faseseparasjonsproteinet fra ankeret og oppløse det kromatin-assosierte kondensatet.
Vi brukte dette verktøyet til å indusere de novo promyelocytic leukemi (PML) kjernefysisk kroppsdannelse på telomerer i telomerase-negative kreftceller som bruker en alternativ forlengelse av telomerer (ALT) bane for telomervedlikehold13,14. PML kjernefysiske organer er membranløse rom involvert i mange kjernefysiske prosesser15,16 og er unikt lokalisert til ALT telomerer for å danne APB-er, for ALT telomer-tilknyttede PML-organer17,18. Telomeres-klynge i APBer, antagelig for å gi reparasjonsmaler for homologistyrt telomer DNA-syntese i ALT19. Faktisk har telomere DNA-syntese blitt oppdaget i APBer og APBer spiller viktige roller i å berike DNA-reparasjonsfaktorer på telomerer20,21. Mekanismene som lå til grunn for APB-montering og telomerklynger i APBer var imidlertid ukjente. Siden telomerproteiner i ALT-celler er unikt modifisert av små allestedsnærværende modifikator (SUMOer)22, inneholder mange APB-komponenter sumoyleringssteder 22,23,24,25 og / eller SUMO-interagerende motiver (SIMer)26,27 og SUMO-SIM interaksjoner driver faseseparasjon28, vi antok at summering på telomerer fører til berikelse av SUMO / SIM som inneholder proteiner og SUMO-SIM-interaksjoner mellom disse proteinene fører til faseseparasjon. PML-protein, som har tre sumoyleringssteder og ett SIM-nettsted, kan rekrutteres til å summere telomerer for å danne APBer og koalescens av flytende APBer fører til telomererklynge. For å teste denne hypotesen brukte vi det kjemiske dimeriseringssystemet til å etterligne sumoyleringsindusert APB-dannelse ved å rekruttere SIM til telomerer (figur 2A)11. GFP smeltes sammen til Haloenzyme for visualisering og til telomerbindende protein TRF1 for å forankre dimmerizeren til telomerer. SIM-kortet er smeltet sammen til eDHFR og mCherry. Kinetikk i kondensatdannelse og dråpefusjonsindusert telomerklynge følges med levende celleavbildning. Faseseparasjon reverseres ved å legge til overflødig fri TMP for å konkurrere med eDHFR-binding. Immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) brukes til å bestemme kondensatsammensetning og telomerisk assosiasjon. Rekruttering av SIM beriker SUMO på telomerer og de induserte kondensatene inneholder PML og er derfor APBer. Rekruttering av en SIM-mutant som ikke kan samhandle med SUMO, beriker ikke SUMO på telomerer eller induserer faseseparasjon, noe som indikerer at den grunnleggende drivkraften for APB-kondensering er SUMO-SIM-interaksjon. Enig med denne observasjonen, polySUMO-polySIM polymerer som smeltet til en TRF2 bindingsfaktor RAP1 kan også indusere APB formasjon29. Sammenlignet med polySUMO-polySIM fusjonssystemet der faseseparasjon oppstår så lenge nok proteiner produseres, induserer den kjemiske dimeriseringsmetoden som presenteres her faseseparasjon på forespørsel og gir dermed bedre tidsoppløsning for å overvåke kinetikken til faseseparasjon og telomerklyngeprosess. I tillegg tillater dette kjemiske dimeriseringssystemet rekruttering av andre proteiner for å vurdere deres evne til å indusere faseseparasjon og telomerklynge. For eksempel kan et forstyrret protein rekruttert til telomerer også danne dråper og klynge telomerer uten å indusere APB-dannelse, noe som tyder på at telomerklynge er uavhengig av APB-kjemi og bare er avhengig av APB flytende egenskap11.
Denne protokollen demonstrerte dannelse og oppløsning av kondensater på telomerer med et kjemisk dimeriseringssystem. Kinetikk av faseseparasjon og dråpefusjonsindusert telomerklynge overvåkes med levende avbildning. Lokalisering og sammensetning av kondensat bestemmes med DNA FISH og protein IF.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er å bestemme protein- og dimerizerkonsentrasjon. Suksessen med å indusere lokal faseseparasjon ved et genomisk locus er avhengig av øk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health (1K22CA23763201 til H.Z., GM118510 til D.M.C.) og Charles E. Kaufman foundation til H.Z. Forfatterne vil takke Jason Tones for korrekturlesing av manuskriptet.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
Pipet Tips | VWR | 10017 | |
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |