Condensados de proteína induzidas por dimerização química em telômeros

Summary

Este protocolo ilustra um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados na cromatina.  Demonstra-se a formação de corpo nuclear de leucemia promielolítica (PML) em telômeros com dimerizadores químicos. O crescimento, a dissolução, a localização e a composição são monitoradas com imagem de células vivas, imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).

Abstract

Os condensados associados à cromatina estão implicados em muitos processos nucleares, mas os mecanismos subjacentes permanecem evasivos. Este protocolo descreve um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados em telômeros. O dimerizer químico consiste em dois ligantes ligados que cada um pode se ligar a uma proteína: ligante halo à enzima halo e trimetoprim (TMP) a E. coli dihidrofolate reductase (eDHFR), respectivamente. Fusão da enzima Halo a uma proteína de telômero ancora dimerizers aos telômeros através da ligação entre ligand ligand-enzima halo covalente. A vinculação do TMP ao eDHFR recruta a fase fundida pelo eDHFR que separa proteínas aos telômeros e induz a formação de condensados. Como a interação TMP-eDHFR não é covalente, a condensação pode ser revertida usando TMP livre em excesso para competir com o dimerizer para a ligação eDHFR. Um exemplo de indução da formação nuclear da leucemia promicocítica (PML) nos telômeros e na determinação do crescimento, dissolução, localização e composição da condensação. Este método pode ser facilmente adaptado para induzir condensados em outros locais genômicos, fundindo halo a uma proteína que se liga diretamente à cromatina local ou ao dCas9 que é direcionado ao lócus genômico com um RNA guia. Ao oferecer a resolução temporal necessária para imagens vivas de células únicas, mantendo a separação de fase em uma população de células para ensaios bioquímicos, este método é adequado para sondar tanto a formação quanto a função de condensados associados à cromatina.

Introduction

Muitas proteínas e ácidos nucleicos sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) e se auto-montam em condensados biomoleculares para organizar a bioquímica nas células^1,2. LLPS de proteínas de ligação de cromatina leva à formação de condensados que estão associados a loci genômicos específicos e estão implicados em várias funções locais de cromatina³. Por exemplo, LLPS de proteína HP1 está por trás da formação de domínios heterocromatinas para organizar o genoma^4,5, LLPS de fatores de transcrição forma centros de transcrição para regular transcrição⁶, LLPS de mRNAs nascentes e proteína de combs multi-sexo gera corpos histonas locus para regular a transcrição e processamento de histone mRNAs⁷.  No entanto, apesar de muitos exemplos de condensados associados à cromatina serem descobertos, os mecanismos subjacentes de formação, regulação e função de condensado permanecem mal compreendidos. Em particular, nem todos os condensados associados à cromatina são formados através de LLPS e avaliações cuidadosas da formação de condensados em células vivas ainda são necessárias^8,9. Por exemplo, a proteína HP1 no camundongo é mostrada ter apenas uma capacidade fraca de formar gotículas líquidas em células vivas e os focos de heterocromatina se comportam como glóbulos polímeros colados¹⁰. Portanto, são desejáveis ferramentas para induzir novos condensados na cromatina em células vivas, particularmente aquelas que permitem o uso de imagens vivas e ensaios bioquímicos para monitorar a cinética da formação de condensados, as propriedades físicas e químicas dos condensados resultantes e as consequências celulares da formação de condensados.

Este protocolo relata um sistema de dimerização química para induzir condensados proteicos na cromatina¹¹ (Figura 1A). O dimerizer consiste em dois ligantes interligadores de proteínas ligados: trimetoprim (TMP) e ligante halo e pode escurecer proteínas fundidas aos receptores cognatos: Escherichia coli dihidrofolate reductase (eDHFR) e uma enzima de alkyldehalogenase bacteriana (enzima halo),^{respectivamente 12}. A interação entre ligante halo e enzima halo é covalente, permitindo que a enzima Halo seja usada como uma âncora, fundindo-a a uma proteína de ligação de cromatina para recrutar uma proteína de separação de fase fundida ao eDHFR à cromatina. Após o recrutamento inicial, o aumento da concentração local da fase de separação da proteína passa pela concentração crítica necessária para a separação de fases e, assim, nuclea um condensado na âncora(Figura 1B). Ao fundir proteínas fluorescentes (por exemplo, mCherry e eGFP) para eDHFR e Halo, a nucleação e o crescimento de condensados podem ser visualizados em tempo real com microscopia de fluorescência. Como a interação entre eDHFR e TMP não é covalente, o TMP livre em excesso pode ser adicionado para competir com o dimerizer para a vinculação eDHFR. Isso liberará então a proteína de separação de fase da âncora e dissolverá o condensado associado à cromatina.

Utilizamos esta ferramenta para induzir a formação nuclear de leucemia promyelocítica (PML) em telômeros em células cancerígenas telomerase-negativas que utilizam um alongamento alternativo de telômeros (ALT) caminho para manutenção de telômeros^13,14.  Os corpos nucleares pml são compartimentos sem membrana envolvidos em muitos processos nucleares^15,16 e são exclusivamente localizados aos telômeros ALT para formar APBs, para os corpos PML associados ao telômero ALT^17,18. Os telômeros agrupam-se dentro dos APBs, presumivelmente para fornecer modelos de reparo para síntese de DNA de telômero direcionada à ímologia em ALT¹⁹. De fato, a síntese de DNA de telômero foi detectada em APBs e APBs desempenham papéis essenciais no enriquecimento de fatores de reparação de DNA nos telômeros^20,21. No entanto, os mecanismos subjacentes à montagem de APB e ao agrupamento de telômeros dentro das APBs eram desconhecidos. Uma vez que as proteínas de telômero em células ALT são modificadas exclusivamente por pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina (SUMOs)^22,muitos componentes APB contêm sítios de sumô ^22,23,24,25 e/ou²⁵ Os motivos que interagem pelo SUMSUMO (SIMs)^26,27 e as interações SUMO-SIM impulsionam a separação de fase^28,hipótesemos que o sumô em telômeros leva ao enriquecimento do SUMO/SIM contendo proteínas e As interações SUM-SIM entre essas proteínas levam à separação de fases.  A proteína PML, que tem três locais de sumô e um site sim, pode ser recrutada para telômeros sumôs para formar APBs e coalescência de APBs líquidos leva ao agrupamento de telômeros. Para testar essa hipótese, utilizamos o sistema de dimerização química para imitar a formação de APB induzida por sumô, recrutando SIM para telômeros(Figura 2A)¹¹. O GFP é fundido à Haloenzyme para visualização e à proteína de ligação de telômeros TRF1 para ancorar o dimerizer aos telômeros. O SIM é fundido para eDHFR e mCherry. Cinéticas da formação de condensado e agrupamento de telômeros induzidos por fusão de gotículas são seguidos com imagens de células vivas.  A separação de fase é revertida adicionando TMP livre de excesso para competir com a vinculação eDHFR. A imunofluorescência (IF) e a fluorescência na hibridização situ (FISH) são utilizadas para determinar a composição do condensado e a associação telômérica. O recrutamento do SIM enriquece o SUM nos telômeros e os condensados induzidos contêm PML e, portanto, são APBs. Recrutar um mutante SIM que não pode interagir com o SUMH não enriquece o SUMô em telômeros ou induz a separação de fases, indicando que a força motriz fundamental para a condensação de APB é a interação SUMO-SIM. Concordando com essa observação, polímeros poliSUMO-polySIM que fundiram-se a um fator de ligação TRF2 RAP1 também podem induzir a formação de APB²⁹. Em comparação com o sistema de fusão polySUMO-polySIM, onde a separação de fase ocorre enquanto proteínas suficientes forem produzidas, a abordagem de dimerização química aqui apresentada induz a separação de fases sob demanda e, portanto, oferece melhor resolução temporal para monitorar a cinética da separação de fases e do processo de agrupamento de telômeros. Além disso, este sistema de dimerização química permite o recrutamento de outras proteínas para avaliar sua capacidade em induzir a separação de fases e agrupamento de telômeros. Por exemplo, uma proteína desordenada recrutada para telômeros também pode formar gotículas e telômeros sem induzir a formação de APB, sugerindo que o agrupamento de telômeros é independente da química apb e depende apenas da propriedade líquida APB¹¹.

Protocol

1. Produção de linhas celulares transitórias Cultura U2OS células aceitadoras em tampas de vidro de 22 x 22 mm (para imagem ao vivo) ou tampas circulares de 12 mm de diâmetro (para IF ou FISH) revestidas com poli-D-lisina em 1 Placa de 6 poços com meio de crescimento (10% soro bovino fetal e 1% solução de penicilina-estreptomicina no DMEM) até atingirem 60-70% de confluência. Substitua o meio de crescimento por meio de transfecção de 1 mL (meio de crescimento sem solução…

Representative Results

Imagens representativas da localização telômica do SUMM identificado pelo DNA de telômero FISH e pela proteína SUME são mostradas na Figura 2. Células com recrutamento de SIM enriqueceram o SUMO1 e o SUMÔ 2/3 nos telômeros em comparação com células com recrutamento mutante SIM. Isso indica que o enriquecimento de SUM induzido por dimerização do SIM nos telômeros depende das interações SUMO-SIM. Um filme de lapso de tempo representativo do TRF1 e D…

Discussion

Este protocolo demonstrou a formação e dissolução de condensados em telômeros com um sistema de dimerização química. Cinéticas de separação de fase e agrupamento de telômeros induzidos por gotículas são monitorados com imagens ao vivo. A localização e a composição do condensado são determinadas com DNA FISH e proteína IF.

Há dois passos críticos neste protocolo. A primeira é determinar a concentração de proteínas e dimerizer. O sucesso em induzir a separação de fase…

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906	Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate	VWR	10861-554
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-101
Anti-mCherry antibody	Abcam	Ab183628
Anti-PML antibody	Santa Cruz	sc966
Anti-SUMO1 antibody	Abcam	Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody	Cytoskeleton	Asm23
Blocking Reagent	Roche	11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML	VWR	89511-258
Circle Cover Slips	Thermo Scientific	3350
Confocal microscope	Nikon	MQS31000
DAPI	Fisher Scientific	D1306
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10017CV
EMCCD Camera	iXon Life	897
Ethanol	Fisher Scientific	4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Gibco	A4766801
Formamide, Deionized	MilliporeSigma	46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Laser merge module	Nikon	NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668027
Figure plotting software, MATLAB	The MathWorks
Microscope Slide Box	Fisher Scientific	34487
Nail Polish	Fisher Scientific	50-949-071
Imaging software, NIS-Elements	Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media	Gibco	51985091
Parafilm	Bemis	13-374-12
PBS 10x, pH 7.4	Fisher Scientific	70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X	Gibco	15140122
Piezo Z-Drive	Physik Instrumente (PI)	91985
Pipet Tips	VWR	10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides	Fisher Scientific	22-037-246
Poly-D-Lysine solution	Sigma-Aldrich	A-003-E
Sodium Azide	Fisher Scientific	BP922I-500
Spinning disk	Yokogawa	CSU-X1
Square Cover Slips	Thermo Scientific	3305
TBS 10x solution	Fisher Scientific	BP2471500
TelC-Alexa488	PNA Bio	F1004
TMP	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
TNH	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
Tris Solution	Fisher Scientific	92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution	MilliporeSigma	64-846-350ML	Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line	From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)	HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	NC9524612