선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색
Summary
여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
원래 Deisseroth 실험실에서 개발한 조직 하이드로겔 탈지법(CLARITY)은 두꺼운 뇌 샘플의 면역 염색 및 이미징에 널리 사용되었습니다. 그러나 이 첨단 기술은 아직 전체 마운트 망막에 사용되지 않았습니다. 망막은 부분적으로 투명하지만, 약 200 μm (마우스)의 두께는 여전히 고해상도 이미징을위한 광 침투를 감소시킬뿐만 아니라 깊은 조직으로 항체의 침투를 제한합니다. 여기서, 우리는 아크릴아미드 단조로 중합하여 나노다공성 하이드로겔을 형성한 다음 단백질 손실을 최소화하고 조직 손상을 피하기 위해 나트륨 도데실 황산염으로 이를 제거함으로써 마우스 망막 전체를 위한 CLARITY 방법을 적용했습니다. CLARITY 처리망막은 망막 뉴런, 글리아 세포 및 시냅스 단백질을 위한 항체로 면역염색되었고, 굴절지수 매칭 용액에 장착되고, 이미지화되었다. 우리의 데이터는 CLARITY가 전체 마운트 준비에서 망막 뉴런 및 신경교 세포를 위한 표준 면역 조직화학 염색 및 화상 진찰의 질을 향상할 수 있다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 도파민성 막막 세포의 미세 축삭 과 수지상 구조의 3D 해상도는 CLARITY에 의해 훨씬 개선되었습니다. 비가공 된 전체 마운트 망막에 비해, CLARITY는 포스트 냅스 밀도 단백질 95와 같은 시냅스 단백질에 대한 면역 스테인링을 나타낼 수 있습니다. 우리의 결과는 CLARITY가 지질제거 후에 망막을 보다 광학적으로 투명하게 만들고 망막 뉴런과 단백질의 미세한 구조를 보존한다는 것을 보여주며, 이는 망막 뉴런과 그 전산 준비에서 그들의 세포 세포 구조의 고해상도 이미징을 얻는 데 일상적으로 사용될 수 있습니다.
Introduction
척추지통은 아마도 중추 신경계 (CNS)의 가장 접근 할 수있는 부분이며 뇌의 발달, 구조 및 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델역할을합니다. 망막에 있는 뉴런의 5개 종류는 2개의 플렉시폼 층에 의해 분리된 3개의 핵 층으로 분포됩니다. 외부 핵층(ONL)은 빛을 전기 신호로 변환하는 고전적인 광수용체(막대 및 원수)로 구성됩니다. 전기 신호는 양극성, 수평 및 막골 세포를 포함하는 내부 핵 층(INL)의 뉴런에 의해 처리된 다음 신경절 세포 층(GCL)에서 망막 신경절 세포(RGC)로 전염된다. RGC는 망막의 출력 뉴런이며, 축축은 이미지 형성 및 비 이미지 형성 시각 기능에 기여하기 위해 뇌에 투사됩니다. 또한, 신경 교 세포의 세 가지 유형 (뮬러 세포, 천체, 마이크로 글리 아) 뉴런에 영양분을 제공 하 고 그들의 세포 외 환경에서 유해한 변화에서 뉴런을 보호.
amacrine 세포의 1개의 특수한 하위 인구는 CNS에 있는 중요한 신경 변조기인 도파민을 생성하고 풀어 놓으며, 빛 적응 도중 망막 신경 회로를재구성1,2. 도파민성 막막 세포(DAC)는 형태학적 프로파일의 독특한 특징을 가지고 있습니다. 그들의 소마타는 내부 플렉시폼 층(IPL)의 가장 단산적인 부분에서 담수체가 마비된 근접 INL에 위치하고 있습니다. DAC의 축슨 과 같은 프로세스는 미근한, 얇고 긴, 희소하게 분기, 곰 정맥류 (도파민 방출의 사이트). 그(것)들은 AII amacrine 세포의 소마타 의 주위에 고리 같이 구조물을 포함하여 IPL에 있는 점선으로 조밀한 신경총을 형성합니다. 축축은 또한 InL을 통해 OPL을 향해 달려가 망막3을가로질러 원심 통로를 형성합니다. 우리는 DAC 프로세스가 양극성 세포 및 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGCs)4,5,6을포함하여 사전 시냅스 뉴런에서 글루타민산 방출에 대한 응답으로 수용체를 발현한다는 것을입증했습니다. 그러나, 글루타민체 수용체가 축축산, 원원수 또는 둘 다에 발현되는지 여부는 수직 망막 섹션에서 차단되어 서로 구별될 수 없기 때문에5,6. 면역 염색은 DC의 3차원 분지 및 세포전 구획에 글루타민산 수용체의 존재를 밝히기 위해 전체 마운트 망막에서 수행되어야 합니다. 망막은 상대적으로 투명하지만 마우스 전체 마운트 망막의 두께는 약 200 μm이며, 이는 심부 조직으로 항체의 침투를 제한할 뿐만 아니라 조직 광 산란으로 인한 고해상도 이미징의 광 침투를 감소시킵니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 면역 염색 호환 조직 하이드로겔 탈면 방법 (CLARITY)를 조정하여 최근 두꺼운 뇌 섹션을 위해 전체 마운트 마우스 망막7에적응시켰다.
CLARITY 방법은 원래 두꺼운 뇌 샘플7의면역 염색 및 이미징을 위한 Deisseroth 실험실에 의해 개발되었다. 강력한 세제, 도데딜 황산나트륨(SDS) 및 전기포고를 사용하여 지질 성분(조직 광산란을 유발함)을 제거하여 단백질과 핵산을 제자리에 두고 있습니다. 제거된 지질은 아크릴아미드와 같은 하이드로겔 단량체로 구성된 투명한 스캐폴드로 대체되어 남은 단백질 구조를 지원합니다. 지워진 조직은 면역 조직 화학을 통해 표지될 수 있고 조직을 통해 실질적으로 증가한 광 침투 깊이로 심화될 수 있습니다 (조직 표면 아래 최대 몇 밀리미터). 그 이후, CLARITY 방법은 여러 연구 그룹에 의해 최적화되고 단순화되어8,9,10. 수정된 CLARITY 프로토콜은 수동 클리어링 기술을 사용하여 전뇌 및 기타 온전한장기(11)를지우기 위해 전기전도에 의해 생성된 조직 손상을 방지한다. 그러나 이 방법은 아직 전체 탈산 망막에 적용되지 않았습니다. 여기서, 우리는 면역 히스토케및 이미징을 위해 더 투명하게 하기 위해 전산 망막에 대한 수동 적인 CLARITY 기술을 조정했습니다. 우리는 시험된 망막 단백질의 대다수가 면역 조직화학을 위한 이 프로세스 도중 보존되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 굴절지수 매칭 솔루션을 사용하여 ONL에서 GCL까지 약 200μm 두께의 망막 뉴런을 전신망막에서 이미지화할 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전체 마운트 망막에 대한 CLARITY 프로토콜의 수정.
우리는 대부분의 이전 연구에서 사용되는 것처럼 진공 배출 또는 건조 챔버없이 적절한 중합을 달성하기 위해 CLARITY 프로토콜을단순화7,9,11. 중합 공정은 산소에 의해 억제되며, 프로토콜의 중합 단계 동안 시료를 공기로부터 분리하도록 요구한다. 그러나, 질소?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
빙예, 네이선 스픽스, 하오 류에게 기술지원을 부탁드립니다. 이 작품은 건강 보조금 EY022640 (D.-Q.Z.) 및 오클랜드 대학 프로보스트 학부 학생 연구 상 (E.J.A.)에 의해 지원되었다.
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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