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Biochimie

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Published: February 04, 2021
doi:
10.3791/62180
, , , ,
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

Summary

Présenté ici est une procédure pour exprimer et purifier la myosine 5a suivie d’une discussion sur sa caractérisation, en utilisant à la fois des essais in vitro de microscopie à fluorescence in vitro à molécule unique et comment ces méthodes peuvent être modifiées pour la caractérisation de la myosine 2b nonmuscle.

Abstract

Les protéines de myosine se lient et interagissent avec l’actine filamenteuse (F-actine) et se trouvent dans les organismes à travers l’arbre phylogénétique. Leur structure et leurs propriétés enzymatiques sont adaptées à la fonction particulière qu’ils exécutent dans les cellules. La myosine 5a marche processivement sur la F-actine pour transporter les mélanosomes et les vésicules dans les cellules. Inversement, la myosine 2b nonmuscle fonctionne comme un filament bipolaire contenant environ 30 molécules. Il déplace la F-actine de polarité opposée vers le centre du filament, où les molécules de myosine travaillent de manière asynchrone pour lier l’actine, donner un coup de puissance et se dissocier avant de répéter le cycle. La myosine 2b non musculaire, ainsi que ses autres isoformes de myosine 2 non musculaires, ont des rôles qui incluent l’adhésion cellulaire, la cytocinèse et le maintien de la tension. La mécanochimie des myosines peut être étudiée en effectuant des tests de motilité in vitro à l’aide de protéines purifiées. Dans le test du filament d’actine planant, les myosines sont liées à une surface de couverture de microscope et transloquent de la F-actine étiquetée par fluorescence, qui peut être suivie. Dans le test de motilité d’une molécule unique / ensemble, cependant, la F-actine est liée à un couvercle et le mouvement des molécules de myosine étiquetées par fluorescence sur la F-actine est observé. Dans ce rapport, la purification de la myosine 5a recombinante à partir de cellules Sf9 par chromatographie d’affinité est décrite. Ensuite, nous décrivons deux essais basés sur la microscopie à fluorescence: le test du filament d’actine glissant et le test de motilité inversée. À partir de ces essais, des paramètres tels que les vitesses de translocation de l’actine et les longueurs et vitesses d’exécution d’une seule molécule peuvent être extraits à l’aide du logiciel d’analyse d’images. Ces techniques peuvent également être appliquées pour étudier le mouvement de filaments simples des isoformes de la myosine 2 nonmuscle, discutées ici dans le contexte de la myosine 2b nonmuscle. Ce flux de travail représente un protocole et un ensemble d’outils quantitatifs qui peuvent être utilisés pour étudier la molécule unique et la dynamique d’ensemble des myosines nonmuscles.

Introduction

Les myosines sont des protéines motrices qui exercent une force sur les filaments d’actine en utilisant l’énergie dérivée de l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP)1. Les myosines contiennent un domaine de la tête, du cou et de la queue. Le domaine principal contient la région de liaison à l’actine ainsi que le site de liaison et d’hydrolyse de l’ATP. Les domaines du cou sont composés de motifs IQ, qui se lient à des chaînes légères, à la calmoduline ou à des protéines de type calmoduline2,3. La région de la queue a plusieurs fonctions spécifiques à chaque classe de myosines, y compris, mais sans s’y limiter, la dimérisation de deux chaînes lourdes, la liaison des molécules de cargaison et la régulation de la myosine via des interactions auto-inhibitoires avec les domaines de la tête1.

Les propriétés mobiles de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre. Certaines de ces propriétés comprennent le rapport de service (la fraction du cycle mécanique de la myosine dans laquelle la myosine est liée à l’actine) et la processivité (la capacité d’un moteur à effectuer plusieurs pas sur sa voie avant le détachement)4. Les plus de 40 classes de myosines ont été déterminées sur la base d’analyses deséquences 5,6,7,8. Les myosines de classe 2 sont classées comme « conventionnelles » puisqu’elles ont été les premières à être étudiées ; toutes les autres classes de myosines sont donc classées comme « non conventionnelles ».

La myosine 5a (M5a) est une myosine de classe 5 et est un moteur processif, ce qui signifie qu’elle peut prendre plusieurs étapes le long de l’actine avant de se dissocier. Il a un rapport de service élevé, indiquant qu’il passe une grande partie de son cycle mécanique lié à l’actine9,10,11,12,13,14. Comme d’autres myosines, la chaîne lourde contient un domaine moteur N-terminal qui comprend à la fois un site d’hydrolyse de liaison à l’actine et un site d’hydrolyse de l’ATP, suivi d’une région du cou qui sert de bras de levier, avec six motifs IQ qui se lient aux chaînes légères essentielles (ELC) et à la calmoduline (CaM)15. La région de la queue contient des bobines enroulées α-hélicoïdales, qui dimérisent la molécule, suivies d’une région de queue globulaire pour la liaison de la cargaison. Sa cinétique reflète son implication dans le transport des mélanosomes dans les mélanocytes et du réticulum endoplasmique dans les neurones de Purkinje16,17. M5a est considéré comme le prototype du moteur de transport demarchandises 18.

Les myosines de classe 2, ou les myosines conventionnelles, comprennent les myosines qui alimentent la contraction des muscles squelettiques, cardiaques et lisses en plus des isoformes de myosine 2 (NM2) non musculaires, NM2a, 2b et 2c19. Les isoformes NM2 se trouvent dans le cytoplasme de toutes les cellules et ont des rôles partagés dans la cytocinèse, l’adhésion, la morphogenèse tissulaire et la migration cellulaire19,20,21,22. Cet article traite des protocoles conventionnels de myosine dans le contexte de la myosine 2b (NM2b)non musculclée 23. NM2b, par rapport à M5a, a un faible rapport de service et est enzymatiquement plus lent avec un Vmax de 0,2 s-123 par rapport au Vmax de M5a de ≈18 s-124. Notamment, les constructions NM2b tronquées avec deux têtes ne se déplacent pas facilement de manière processive sur l’actine; au contraire, chaque rencontre avec l’actine entraîne un coup de puissance suivi d’une dissociation de la molécule25.

NM2b contient deux chaînes lourdes de myosine, chacune avec un domaine de tête globulaire, un bras de levier (avec un ELC et une chaîne légère régulatrice (RLC)), et un domaine de tige / queue enroulée α-hélicoïdale, d’environ 1 100 acides aminés de long, qui dimérise ces deux chaînes lourdes. L’activité enzymatique et l’état structurel du NM2b sont régulés par phosphorylation du RLC23. Le NM2b non phosphorylé, en présence d’ATP et de forces ioniques physiologiques (environ 150 mM de sel), adopte une conformation compacte dans laquelle les deux têtes font participer à une interaction asymétrique et la queue se replie sur les têtes en deux endroits23. Dans cet état, la myosine n’interagit pas fortement avec l’actine et a une très faible activité enzymatique. Lors de la phosphorylation RLC par la kinase à chaîne légère de la myosine dépendante de la calmoduline (MLCK) ou la protéine kinase associée à rho, la molécule s’étend et s’associe à d’autres myosines à travers la région de la queue pour former des filaments bipolaires d’environ 30 molécules de myosine23. La phosphorylation susmentionnée du RLC entraîne également une augmentation de l’activité de l’ATPase activée par l’actine de NM2b d’environ quatre fois26,27,28. Cet arrangement de filament bipolaire, avec de nombreux moteurs de myosine à chaque extrémité, est optimisé pour les rôles de contraction et de maintien de la tension, où les filaments d’actine avec des polarités opposées peuvent être déplacés les uns par rapport aux autres23,29. En conséquence, il a été démontré que le NM2b agit comme un ensemble de moteurs lorsqu’il interagit avec l’actine. Le grand nombre de moteurs à l’intérieur de ce filament permet aux filaments NM2b de se déplacer de manière processive sur les filaments d’actine, ce qui rend la processivité du filament in vitro possible pour caractériser29.

Bien que des progrès aient été réalisés dans la compréhension du rôle des myosines dans la cellule, il est nécessaire de comprendre leurs caractéristiques individuelles au niveau des protéines. Pour comprendre les interactions de l’actomyosine à un niveau d’interaction protéine-protéine simple, plutôt qu’à l’intérieur d’une cellule, nous pouvons exprimer et purifier les myosines recombinantes pour une utilisation dans des études in vitro. Les résultats de telles études informent ensuite les mécanobiologistes sur les propriétés biophysiques de myosines spécifiques qui conduisent finalement des processus cellulaires complexes12,13,14,25,29. Typiquement, cela est accompli en ajoutant une étiquette d’affinité à une construction de myosine pleine longueur ou tronquée et en purifiant par chromatographie d’affinité29,30,31. De plus, la construction peut être modifiée pour inclure un fluorophore génétiquement codé ou une étiquette pour le balisage des protéines avec un fluorophore synthétique. En ajoutant une telle étiquette fluorescente, des études d’imagerie à molécule unique peuvent être effectuées pour observer la mécanique et la cinétique de la myosine.

Après la purification, la myosine peut être caractérisée de plusieurs façons. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par des méthodes colorimétriques, fournissant un aperçu de la consommation d’énergie globale et de l’affinité actine du moteur dans différentes conditions32. Pour en savoir plus sur la mécanochimie de sa motilité, d’autres expériences sont nécessaires. Cet article détaille deux méthodes basées sur la microscopie à fluorescence in vitro qui peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés mobiles d’une protéine de myosine purifiée.

La première de ces méthodes est le test du filament d’actine planant, qui peut être utilisé pour étudier quantitativement les propriétés d’ensemble des moteurs de myosine, ainsi que pour étudier qualitativement la qualité d’un lot de protéine purifiée33. Bien que cet article traite de l’utilisation de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) pour ce test, ces expériences peuvent être réalisées efficacement à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique, que l’on trouve couramment dans de nombreux laboratoires34. Dans ce test, une couche saturante de moteurs à myosine est attachée à un couvercle. Cela peut être accompli en utilisant de la nitrocellulose, des anticorps, des membranes, des surfaces dérivatisées enSiO2(telles que le triméthylchlorosilane), entre autres29,33,35,36,37,38. Les filaments d’actine marqués par fluorescence sont passés à travers la chambre de couverture, sur laquelle l’actine se lie à la myosine attachée à la surface. Lors de l’ajout d’ATP (et de kinases dans l’étude de NM2), la chambre est imagée pour observer la translocation des filaments d’actine par les myosines liées à la surface. Un logiciel de suivi peut être utilisé pour corréler la vitesse et la longueur de chaque filament d’actine planant. Un logiciel d’analyse peut également fournir une mesure du nombre de filaments d’actine mobiles et stationnaires, ce qui peut être utile pour déterminer la qualité d’une préparation de myosine donnée. La proportion de filaments bloqués peut également être intentionnellement modulée par attache de surface de l’actine à d’autres protéines et mesurée pour déterminer la dépendance à la charge de la myosine39. Étant donné que chaque filament d’actine peut être propulsé par un grand nombre de moteurs disponibles, ce test est très reproductible, la vitesse finale mesurée étant robuste aux perturbations telles que les altérations de la concentration de myosine de départ ou la présence de facteurs supplémentaires dans la solution. Cela signifie qu’il peut être facilement modifié pour étudier l’activité de la myosine dans différentes conditions, telles que la phosphorylation altérée, la température, la force ionique, la viscosité de la solution et les effets de la charge induite par les attaches de surface. Bien que des facteurs tels que les « têtes mortes » de myosine à forte liaison incapables d’hydrolyse de l’ATP puissent provoquer des filaments d’actine bloqués, de multiples méthodes existent pour atténuer ces problèmes et permettre des mesures précises. Les propriétés cinétiques de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre et, selon la myosine spécifique utilisée, la vitesse de glissement du filament d’actine dans ce test peut varier de moins de 20 nm / s (myosine9) 40,41, et jusqu’à 60 000 nm / s (myosine characée 11)42.

Le second essai inverse la géométrie du test du filament d’actine glissant12. Ici, les filaments d’actine sont attachés à la surface de couverture et le mouvement de molécules uniques de M5a ou de filaments bipolaires individuels de NM2b est visualisé. Ce test peut être utilisé pour quantifier les longueurs et les vitesses d’exécution de molécules ou de filaments de myosine simples sur l’actine. Un couvercle est recouvert d’un composé chimique qui bloque la liaison non spécifique et fonctionnalise simultanément la surface, tel que la biotine-polyéthylène glycol (biotine-PEG). L’ajout de dérivés d’avidine modifiés amorce ensuite la surface et l’actine biotinylée est passée à travers la chambre, ce qui donne une couche de F-actine liée de manière stable au fond de la chambre. Enfin, la myosine activée et étiquetée par fluorescence (généralement 1-100 nM) est acheminée à travers la chambre, qui est ensuite imagée pour observer le mouvement de la myosine sur les filaments d’actine stationnaires.

Ces modalités représentent des méthodes rapides et reproductibles qui peuvent être utilisées pour examiner la dynamique des myosines non musculaires et musculaires. Ce rapport décrit les procédures pour purifier et caractériser à la fois M5a et NM2b, représentant respectivement les myosines non conventionnelles et conventionnelles. Ceci est suivi d’une discussion de certaines des adaptations spécifiques à la myosine, qui peuvent être effectuées pour obtenir une capture réussie du mouvement dans les deux types de test.

Expression et biologie moléculaire
L’ADNc de la myosine d’intérêt doit être cloné sur un vecteur pFastBac1 modifié qui code soit pour une balise FLAG terminale C (DYKDDDDK) si elle exprime M5a-HMM, soit pour une balise FLAG N-terminale si elle exprime la molécule pleine longueur de NM2b23,43,44,45,46. Les marqueurs FLAG C-terminal sur NM2b entraînent une affinité affaiblie de la protéine pour la colonne d’affinité FLAG. En revanche, la protéine marquée N-terminally FLAG se lie généralement bien à la colonne d’affinité FLAG23. La protéine marquée N-terminale conserve l’activité enzymatique, l’activité mécanique et la régulation dépendante de la phosphorylation23.

Dans cet article, une construction de type M5a de type Mromyosine lourde (HMM) de souris tronquée avec un GFP entre l’étiquette FLAG et le terminus C de la chaîne lourde de myosine a été utilisée. Notez que contrairement à NM2b, M5a-HMM peut être étiqueté et purifié avec succès avec des balises FLAG N ou C-terminal et dans les deux cas, la construction résultante sera active. La chaîne lourde M5a a été tronquée à l’acide aminé 1090 et contient un tritrateur d’acides aminés (GCG) entre le GFP et la région de la bobine enroulée du M5a47. Aucun éditeur de liens supplémentaire n’a été ajouté entre le GFP et la balise FLAG. M5a-HMM a été co-exprimé avec la calmoduline. La construction NM2b humaine pleine longueur a été co-exprimée avec ELC et RLC. Le N-termini du RLC a été fusionné avec un GFP via un linker de cinq acides aminés (SGLRS). Directement attaché à la balise FLAG était un HaloTag. Entre le HaloTag et le N-terminus de la chaîne lourde de la myosine se trouvait un linker composé de deux acides aminés (AS).

Les deux préparations de myosine ont été purifiées à partir d’un litre de culture cellulaire Sf9 infectée par le baculovirus à une densité d’environ 2 x 106 cellules / mL. Les volumes du baculovirus pour chaque sous-unité dépendaient de la multiplicité d’infection du virus telle que déterminée par les instructions du fabricant. Dans le cas de M5a, les cellules ont été co-infectées par deux baculovirus différents, l’un pour la calmoduline et l’autre pour la chaîne lourde M5a. Dans le cas du NM2b, les cellules ont été co-infectées par trois virus différents: un pour ELC, un pour RLC et un pour nm2b chaîne lourde. Pour les laboratoires travaillant avec une diversité de myosines (ou d’autres protéines multi-complexes), cette approche est efficace car elle permet de nombreuses combinaisons de chaînes lourdes et légères et les chaînes légères couramment utilisées telles que la calmoduline peuvent être co-transfectées avec de nombreuses chaînes lourdes de myosine différentes. Tous les travaux cellulaires ont été effectués dans une armoire de biosécurité avec une technique stérile appropriée pour éviter la contamination.

Pour l’expression de M5a et NM2b, les cellules Sf9 produisant les myosines recombinantes ont été collectées 2 à 3 jours après l’infection, par centrifugation, et stockées à -80 °C. Les pastilles cellulaires ont été obtenues en centrifugant les cellules Sf9 co-infectées à 4 °C pendant 30 min à 2 800 x g. Le processus de purification des protéines est détaillé ci-dessous.

Protocol

1. Purification des protéines Lyse cellulaire et extraction de protéines Préparez un tampon d’extraction 1,5x basé sur le tableau 1. Filtrer et conserver à 4 °C. Commencez à décongeler les granulés de cellules sur la glace. Pendant que les granulés sont en train de décongeler, complétez 100 mL de tampon d’extraction avec 1,2 mM de dithiothréitol (DTT), 5 μg/mL de leupeptine, 0,5 μM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et deux comprimés inhibiteurs…

Representative Results

La purification de la myosine peut être évaluée en effectuant une électrophorèse sur gel-polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) réductrice comme le montre la figure 2. Bien que cette figure représente la myosine finale post-dialysée, SDS-PAGE peut être effectuée sur des aliquotes des différentes étapes de la procédure de purification pour identifier les produits perdus par le surnageant. Myosin 5a HMM a une bande dans la gamme 120-130 kDa et la myosine 2b non mus…

Discussion

Présenté ici est un flux de travail pour la purification et la caractérisation in vitro de la myosine 5a et de la myosine 2b nonmuscle. Cet ensemble d’expériences est utile pour quantifier les propriétés mécanochimiques des constructions de myosine purifiée de manière rapide et reproductible. Bien que les deux myosines présentées ici ne soient que deux exemples spécifiques parmi les nombreuses possibilités, les conditions et les techniques peuvent être appliquées, avec une certaine adaptation, à la plup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Fang Zhang pour son assistance technique dans la préparation des réactifs utilisés pour la collecte de ces données. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros NHLBI/NIH HL001786 à J.R.S.

Materials

1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper – Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper – Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish – Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish – Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
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Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).
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