Creazione di chimere del proencefalo aviario per valutare lo sviluppo facciale
Summary
Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stata progettata per testare le proprietà di segnalazione e pattern del proencefalo basale durante lo sviluppo craniofacciale.
Abstract
L’embrione aviario è stato utilizzato come sistema modello per più di un secolo e ha portato a una comprensione fondamentale dello sviluppo dei vertebrati. Uno dei punti di forza di questo sistema modello è che l’effetto e l’interazione tra i tessuti possono essere valutati direttamente negli embrioni chimerici. Abbiamo precedentemente dimostrato che i segnali provenienti dal proencefalo contribuiscono alla morfogenesi facciale regolando la forma del dominio di espressione del riccio sonico (SHH) nella zona ectodermica frontonasale (FEZ). In questo articolo, viene descritto il metodo per generare le chimere del proencefalo e fornire illustrazioni dei risultati di questi esperimenti.
Introduction
Gran parte della ricerca contemporanea in biologia dello sviluppo si concentra sul ruolo dei geni nella formazione degli embrioni. Ci sono buoni strumenti per esaminare i meccanismi di sviluppo da una prospettiva genetica. Tuttavia, gli embrioni vengono assemblati e subiscono morfogenesi in risposta alle interazioni tissutali. Il sistema aviario è uno strumento classico utilizzato per valutare la varietà di interazioni tissutali che regolano lo sviluppo per i seguenti motivi: l’embriologia è ben compresa, gli embrioni sono facilmente accessibili, gli strumenti per l’analisi dei sistemi aviari sono ben sviluppati e gli embrioni sono poco costosi.
Il sistema di trapianto aviario è stato ampiamente utilizzato per tracciare il lignaggio e per valutare le interazioni tissutali durante lo sviluppo per quasi un secolo 1,2,3,4. Questo sistema è stato utilizzato per studiare un centro di segnalazione, la zona ectodermica frontonasale (FEZ), che regola la morfogenesi della mascella superiore5, ed è stato pubblicato un video che descrive quella tecnica in precedenza6. Oltre al pulcino di quaglia, altre specie sono state utilizzate anche per produrre chimere per l’analisi delle interazioni tissutali. Ad esempio, il topo FEZ è stato trapiantato da topi selvatici di tipo7 e topi mutanti8, e altri hanno utilizzato un sistema di anatra, quaglia e pulcino per valutare il ruolo della cresta neurale nel modellare lo scheletro facciale 9,10,11,12.
In questo lavoro, è stato valutato il ruolo del proencefalo nella regolazione del modello di espressione genica nella zona FEZ trapiantando reciprocamente il proencefalo ventrale tra embrioni di quaglia, anatra e pulcino, perché è necessario un segnale dal proencefalo per indurre l’espressione del riccio sonico nella FEZ. I trapianti di proencefalo non sono unici nel campo. Questi trapianti sono stati utilizzati per valutare lo sviluppo della motilità negli embrioni di quaglia e anatra13, sebbene in questi esperimenti siano stati trapiantati anche tessuti che hanno contribuito a derivati non neurali. In altri lavori, i circuiti uditivi negli uccelli sono stati valutati mediante trapianto di proencefalo14, ma questi trapianti contenevano presunte cellule della cresta neurale, che contribuiscono alla forma del viso 9,10 e partecipano alla regolazione dell’espressione di SHH nella FEZ 15. Quindi, è stato ideato un sistema per trapiantare solo il proencefalo ventrale da una specie di uccello a un’altra prima della chiusura del tubo neurale per valutare il ruolo del cervello nella forma facciale16 (Figura 1A, B). Questo metodo era privo di contaminazione della cresta neurale dell’innesto. In questo articolo, il metodo è illustrato e vengono descritti i risultati attesi e vengono discusse le sfide affrontate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto consente l’esame delle interazioni tissutali tra il proencefalo basale e l’ectoderma adiacente. Questo approccio differisce dai precedenti metodi di trapianto del proencefalo, perché il tessuto del donatore era limitato al proencefalo ventrale. Questo elimina il trapianto delle cellule della cresta neurale, che hanno dimostrato di partecipare al pattern della morfologia facciale 9,10. Quindi, limitare l’innesto al proencefalo basale era essen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental and Craniofacial Research del National Institutes of Health con i numeri di premio R01DE019648, R01DE018234 e R01DE019638.
Materials
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35×10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
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