Opprette Avian Forebrain Chimeras for å vurdere ansiktsutvikling

Summary

Denne artikkelen beskriver en vevstransplantasjonsteknikk som ble designet for å teste signalerings- og mønsteregenskapene til basal forhjerne under kraniofacial utvikling.

Abstract

Fugleembryoet har blitt brukt som modellsystem i mer enn et århundre og har ført til grunnleggende forståelse av virveldyrutvikling. En av styrkene til dette modellsystemet er at effekten av og interaksjonen mellom vev kan vurderes direkte i kimære embryoer. Vi har tidligere vist at signaler fra forhjernen bidrar til ansiktsmorfogenese ved å regulere formen på uttrykksdomenet til Sonic hedgehog (SHH) i Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). I denne artikkelen beskrives metoden for å generere forhjernekimærene og gi illustrasjoner av resultatene av disse forsøkene.

Introduction

Mye moderne forskning innen utviklingsbiologi fokuserer på genenes rolle i å forme embryoer. Det finnes gode verktøy for å undersøke utviklingsmekanismer fra et genetisk perspektiv. Imidlertid er embryoer samlet og gjennomgår morfogenese som respons på vevsinteraksjoner. Fuglesystemet er et klassisk verktøy som brukes til å vurdere ulike vevsinteraksjoner som regulerer utviklingen av følgende grunner: embryologien er godt forstått, embryoene er lett tilgjengelige, verktøy for analyse av aviære systemer er godt utviklet, og embryoene er billige.

Fugletransplantasjonssystemet har vært mye brukt for avstamningssporing og for å vurdere vevsinteraksjoner under utvikling i nesten et århundre 1,2,3,4. Dette systemet ble brukt til å undersøke et signalsenter, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), som regulerer morfogenese i overkjeven⁵, og en video ble publisert som beskriver denne teknikken tidligere⁶. I tillegg til vaktelkylling har andre arter også blitt brukt til å produsere kimærer for analyse av vevsinteraksjoner. For eksempel ble musen FEZ transplantert fra vill type⁷ og mutante mus⁸, og andre har brukt et ande-, vaktel- og kyllingsystem for å vurdere rollen som nevralkam i mønster av ansiktsskjelettet 9,10,11,12.

I dette arbeidet ble forhjernens rolle i å regulere mønsteret av genuttrykk i FEZ ved å transplantere den ventrale forhjernen gjensidig blant vaktel-, and- og kyllingembryoer vurdert, fordi et signal fra forhjernen er nødvendig for å indusere Sonic pinnsvinuttrykk i FEZ. Forhjernetransplantasjoner er ikke unike i feltet. Disse transplantasjonene ble brukt til å vurdere utviklingen av motilitet i vaktel- og andeembryoer¹³, men i disse forsøkene ble vev som bidro til ikke-nevrale derivater også transplantert. I annet arbeid har hørselskretser hos fugler blitt vurdert ved hjernetransplantasjon¹⁴, men disse transplantasjonene inneholdt presumptive nevrale kamceller, som bidrar til ansiktsform ^9,10 og deltar i regulering av SHH-uttrykk i FEZ ¹⁵. Derfor ble det utviklet et system for å transplantere bare den ventrale forhjernen fra en fugleart til en annen før lukking av nevralrøret for å vurdere hjernens rolle i ansiktsform¹⁶ (figur 1A,B). Denne metoden var blottet for nevralkamforurensning av transplantatet. I denne artikkelen illustreres metoden og de forventede resultatene beskrives, og utfordringene drøftes.

Protocol

Hvit pekinand (Anas platyrhynchos), hvit leghornkylling (Gallus gallus) og japansk vaktel (Cortunix coturnix japonica) ruges ved 37 °C i et fuktet kammer til den matches på HH7/817. 1. Klargjøring av donorvevet MERK: Fremstilling av reagenser og verktøy og hvordan man åpner egg for eksperimentell manipulasjon er beskrevet6. Forbered DMEM-medier med nøytral rød, en glassoverf?…

Representative Results

Vurdering av kimerisme og transplantasjonsforurensningFor å vurdere kimærene, bør omfanget av kimerisme og forurensning av transplantatet med andre celletyper behandles. Å lage kimærer ved å transplantere vaktelvev i kyllingembryoer muliggjør denne typen analyse. Ved hjelp av QCPN-antistoffet kan vaktelceller visualiseres og skilles fra vertsvevet (figur 1 C,D). I dette tilfellet ble bare vev avledet fra den ventrale forhjernen farget med antistof…

Discussion

Den beskrevne metoden tillater undersøkelse av vevsinteraksjonene mellom den basale forhjernen og den tilstøtende ektodermen. Denne tilnærmingen skiller seg fra tidligere forhjernetransplantasjonsmetoder, fordi donorvevet var begrenset til den ventrale forhjernen. Dette eliminerer transplantasjon av nevrale kamceller, som har vist seg å delta i mønster ansikts morfologi ^9,10. Derfor var det viktig å begrense transplantatet til basal forhjerne for å evaluer…

Materials

1x PBS	TEK	TEKZR114
35×10 mm Petri dish	Falcon	1008
DMEM	Thermofisher	11965084
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Neutral Red	Sigma	553-24-2
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Pasteur Pipets	Thermofisher	13-678-6B
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000