यहां, क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी (एसएक्सटी) में आवश्यक नमूना तैयारी और डेटा संग्रह चरणों का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल 25 एनएम हाफ पिच के रिज़ॉल्यूशन पर पूरे क्रायो-संरक्षित कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर की छवि के लिए प्रस्तुत किया गया है।
जैविक अनुसंधान और संबंधित क्षेत्रों में सेल संगठन और मशीनरी को समझने के लिए इमेजिंग तकनीकें मौलिक हैं। इन तकनीकों में से, क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी (एसएक्सटी) पानी की खिड़की एक्स-रे ऊर्जा रेंज (284-543 ईवी) में पूरे क्रायो-संरक्षित कोशिकाओं को इमेजिंग करने की अनुमति देता है, जिसमें कार्बन संरचनाओं में पानी की तुलना में आंतरिक रूप से उच्च अवशोषण होता है, जिससे प्रत्येक वोक्सेल में निहित सामग्री के रैखिक अवशोषण गुणांक के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति मिलती है। 10 μm मोटी तक पूरी कोशिकाओं के स्तर पर मात्रात्मक संरचनात्मक जानकारी तब इस तरह से प्राप्त की जा सकती है, जिसमें उच्च थ्रूपुट और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन 25-30 एनएम हाफ-पिच तक नीचे है। क्रायो-एसएक्सटी ने वर्तमान बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए खुद को प्रासंगिक साबित किया है, सेलुलर संक्रमण प्रक्रियाओं (वायरस, बैक्टीरिया, या परजीवी) पर 3 डी जानकारी प्रदान करता है, बीमारियों (जैसे अप्रभावी आनुवंशिक रोगों) के कारण रूपात्मक परिवर्तन और सेलुलर स्तर पर दवा की कार्रवाई को समझने में हमारी मदद करता है, या 3 डी सेलुलर वातावरण में विशिष्ट संरचनाओं का पता लगाता है। इसके अलावा, सिंक्रोट्रॉन सुविधाओं में ट्यूनेबल तरंग दैर्ध्य का लाभ उठाकर, स्पेक्ट्रो-माइक्रोस्कोपी या इसके 3 डी समकक्ष, स्पेक्ट्रो-टोमोग्राफी का उपयोग सेल में विशिष्ट तत्वों की छवि और मात्रा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि जैवखनिजीकरण प्रक्रियाओं में कैल्शियम। क्रायो-एसएक्सटी अन्य जैविक इमेजिंग तकनीकों जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एक्स-रे प्रतिदीप्ति या दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति के लिए पूरक जानकारी प्रदान करता है, और आमतौर पर कार्य, स्थान और आकृति विज्ञान को जोड़ने के लिए क्रायोजेनिक स्थितियों में 2 डी या 3 डी कोरिलेटिव इमेजिंग के लिए एक साथी विधि के रूप में उपयोग किया जाता है।
क्रायो-एसएक्सटी जैविक इमेजिंग अनुसंधान में एक केंद्रीय भूमिका निभा सकता है क्योंकि यह हाइड्रेटेड पूरी कोशिकाओं के 1,2,3,4,5,6 के 3 डी मध्यम रिज़ॉल्यूशन (25-30 एनएम आधा पिच) वॉल्यूम प्रदान करता है। पानी की खिड़की ऊर्जा सीमा में, कार्बन और ऑक्सीजन अवशोषण के किनारों (4.4-2.3 एनएम) के बीच, कार्बन समृद्ध सेलुलर संरचनाएं ऑक्सीजन-समृद्ध माध्यम की तुलना में 10 गुना अधिक अवशोषित करती हैं जो उन्हें घेरती हैं और उन्हें घेरती हैं। इस ऊर्जा सीमा में, 10 μm मोटाई तक विट्रीफाइड कोशिकाओं को सेक्शनिंग या धुंधला होने की आवश्यकता के बिना चित्रित किया जा सकता है, जिससे मात्रात्मक उच्च अवशोषण विपरीत अनुमान होते हैं, जो नमूना रोटेशन क्षमताओं के साथ संयुक्त, सेलुलर संरचना के टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण की अनुमति देते हैं। क्रायो-एसएक्सटी नमूना आयामों और स्थानिक संकल्प के मामले में एक आला भरता है जो किसी भी अन्य इमेजिंग तकनीक द्वारा आसानी से सुलभ नहीं है।
संक्षेप में, क्रायो-एसएक्सटी का अवशोषण कंट्रास्ट मात्रात्मक है, क्योंकि मोटाई टी के नमूने के माध्यम से फोटॉनों का क्षीणन बीयर-लैम्बर्ट कानून का पालन करता है: , जहां मैं0 घटना की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है और रैखिक अवशोषण गुणांक μ करता है, जो तरंग दैर्ध्य और नमूने के अपवर्तक सूचकांक के β काल्पनिक भाग पर निर्भर करता है ( ). क्षीणन जैव रासायनिक संरचना का एक कार्य है और संरचनाओं की मोटाई को चित्रित किया जा रहा है, जिसमें प्रत्येक जैव रासायनिक घटक में एक विशिष्ट एक्स-रे रैखिक अवशोषण गुणांक होता है μएल (एलएसी)। इसका मतलब यह है कि प्रत्येक टोमोग्राफी वोक्सेल मान रासायनिक तत्वों और उस वोक्सेल 7 में उनकी एकाग्रता पर निर्भर करताहै। यह नाभिक, न्यूक्लियोली, लिपिड निकायों या माइटोकॉन्ड्रिया, या क्रोमैटिन के विभिन्न संघनन राज्यों जैसे विभिन्न ऑर्गेनेल के प्राकृतिक भेदभाव के लिए अनुमति देता है जो केवल उनके अंतर्निहित एलएसी मूल्यों के आधार पर 2,8,9 पुनर्निर्मित होते हैं।
इसके अलावा, क्रायो-एसएक्सटी एक उच्च थ्रूपुट तकनीक है जिसमें टोमोग्राम कुछ ही मिनटों में एकत्र किए जाते हैं। यह विशेष रूप से सेल आबादी के मेसोस्केल इमेजिंग को सक्षम बनाता है जिसे विभाजन, भेदभाव और एपोप्टोसिस जैसे प्रमुख समय बिंदुओं पर कब्जा किया जा सकता है, लेकिन विभिन्न प्रतिक्रिया राज्यों में भी जैसे कि विशिष्ट दवा उपचारों या रोगजनक संक्रमणों के लिए रासायनिक जोखिम से प्रेरित। उन प्रमुख बिंदुओं पर एकत्र किए गए डेटा उन विशिष्ट क्षणों में विभिन्न सेलुलर ऑर्गेनेल के स्थानिक संगठन के एक वफादार रिकॉर्ड के साथ सिस्टम का 3 डी विवरण प्रदान करेंगे।
आमतौर पर, क्रायो-एसएक्सटी का उपयोग अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में किया जाता है जो कि 3 डी सेलुलर वातावरण 4,10,11,12,13,14,15,16, या हार्ड एक्स-रे प्रतिदीप्ति डेटा 17,18 के भीतर विशिष्ट विशेषताओं, घटनाओं या मैक्रोमोलेक्यूल्स का पता लगाने की अनुमति देता है। . क्रायोजेनिक स्थितियों में correlative दृष्टिकोण ब्याज की प्रणाली की सबसे पूर्ण और मूल्यवान तस्वीर प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं। मिस्ट्रल (अल्बा) और बी 24 (डायमंड) क्रायो-एसएक्सटी बीमलाइनों पर विशिष्ट वर्कफ़्लो का एक संक्षिप्त सारांश चित्र 1 में स्केच किया गया है।
इसके अलावा, सिंक्रोट्रॉन सुविधाओं में तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग क्षमता का लाभ उठाते हुए, स्पेक्ट्रोस्कोपिक जानकारी नमूने में निहित विशेष तत्वों के विशिष्ट विभेदक अवशोषण का उपयोग करके संरचनात्मक एक के अलावा प्राप्त की जा सकती है। इसका एक उदाहरण19,20,21 कोशिकाओं में जैवखनिजीकरण प्रक्रियाओं के अध्ययन में कैल्शियम का स्थान होगा। विभिन्न फोटॉन ऊर्जा (स्पेक्ट्रा) या टोमोग्राम पर 2 डी छवियों को नीचे और ब्याज के एक्स-रे अवशोषण किनारे पर लेने से, चयनित तत्व वाले पिक्सेल या वोक्सेल की पहचान की जा सकती है। स्पेक्ट्रा रासायनिक राज्यों को अलग करने की भी अनुमति देता है (यानी, हाइड्रोक्सियापैटाइट के लिए अनाकार कैल्शियम का विकास जैसा कि पिछले जैव खनिजीकरण उदाहरण20 में है)। 2डी और 3डी में विभिन्न तत्वों का परिमाणीकरण संभव है। विट्रीफाइड कोशिकाओं की स्पेक्ट्रोस्कोपिक इमेजिंग आमतौर पर पानी की खिड़की में की जाती है, लेकिन अन्य ऊर्जा श्रेणियों में भी संभव है यदि पानी की मात्रा पर्याप्त रूप से कम है या यदि निर्जलीकरण सहित अन्य नमूना तैयारीप्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है। एक विस्तृत स्पेक्ट्रोस्कोपी चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल के फोकस से परे है।
इस प्रकार, प्रोटोकॉल प्रमुख नमूना तैयारी चरणों को संक्षेप में सारांशित करने पर केंद्रित है, हालांकि प्रत्येक प्रणाली को व्यक्तिगत शोधन की आवश्यकता हो सकती है, इसके बाद क्रायो सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण डेटा संग्रह प्रक्रिया हो सकती है।
नमूना तैयारी उच्च गुणवत्ता वाले नरम एक्स-रे टोमोग्राम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि उनकी गुणवत्ता सीधे नमूना विट्रीफिकेशन की गुणवत्ता और बर्फ की परत की मोटाई पर निर्भर करती है जिसमें सेल एम्बेडेड है। उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात वाले अनुमानों को पतली बर्फ की परत वाले क्षेत्रों में एकत्र किया जाएगा, जिससे उच्चतम संभव रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए आवश्यक विकिरण खुराक को कम करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, सेल confluency भी अंतिम tomogram गुणवत्ता को प्रभावित करेगा, क्योंकि एक पड़ोसी कोशिकाओं रोटेशन पर FoV में प्रवेश करने से बचना चाहिए। अंत में, Au fiducial मार्करों का सही फैलाव प्रक्षेपण संरेखण की सटीकता को निर्धारित करेगा और फिर अंततः अंतिम 3 डी पुनर्निर्मित मात्रा की गुणवत्ता निर्धारित करेगा। ध्यान दें कि ग्रिड पर Au fiducials का एक उचित प्रसार प्रक्षेपण संरेखण चरण के स्वचालितकरण को सक्षम बनाता है, जिसके बिना इस तरह के एक महत्वपूर्ण कदम के लिए एक उच्च विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।
यहां प्रोटोकॉल केवल एक संभावित नमूना तैयारी रणनीति को दर्शाता है, जिसमें क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) में उपयोग किए जाने वाले लोगों के साथ समानताएं हैं। दोनों मामलों में, बेहतर पुनरुत्पादन के लिए मांग नमूना तैयारी में सुधार करने वाले प्रोटोकॉल इन तकनीकों की सफलता के लिए मौलिक होंगे, औरइस लक्ष्य की ओर प्रयास किए जा रहे हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि अलग-अलग कोशिकाओं की इमेजिंग के अलावा, ऊतक के वर्गों को भी कल्पना की जा सकती है बशर्ते कि अनुभाग के माध्यम से संचरण संकेत उच्च झुकाव कोणों पर पर्याप्त हो। आमतौर पर, यह कुछ माइक्रोन (10 μm से नीचे) के वर्गों का मतलब होगा।
एक सेल के अंदर एक विशिष्ट संरचना या घटना की छवि बनाने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि यह विशेष सुविधा झुकाव श्रृंखला के एफओवी के अंदर है। जैसा कि क्रायो-एसएक्सटी में एफओवी 10 x 10 μm2 से 15 x 15 μm 2 तक सीमित है, लेंस के आधार पर और कम से कम2 के कारक के लिए रिज़ॉल्यूशन के पिक्सेल ओवरसैम्पलिंग के लिए लेखांकन, यह अक्सर पूर्ण सेल एक्सटेंशन से छोटा होता है (चित्रा 5 में इंगित लाल वर्ग देखें)। इसलिए, ROI पाया जाना चाहिए और ठीक से लेबल किया जाना चाहिए। यह आमतौर पर फ्लोरोसेंट टैग और दृश्यमान प्रकाश correlative दृष्टिकोण के माध्यम से किया जाता है। एपिफ्लोरेसेंस के संयोजन वाली 2 डी रणनीतियां सीधी हैं क्योंकि नरम एक्स-रे ट्रांसमिशन माइक्रोस्कोप में एक एकीकृत ऑन-लाइन दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप होता है, लेकिन उच्च रिज़ॉल्यूशन 2 डी या 3 डी प्रतिदीप्ति संकेत के लिए अन्य दृष्टिकोण भी उपलब्ध हैं 4,12,13,15,16 . उन मामलों में, ग्रिड को पहले विशिष्ट उपकरणों जैसे सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप में चित्रित करने की आवश्यकता होती है। ध्यान दें कि सबसे कुशल correlative दृष्टिकोण वे हैं जो क्रायोजेनिक स्थितियों में डेटा संग्रह को शामिल करते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि कमरे के तापमान (आरटी), दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति इमेजिंग, और नमूना विट्रीफिकेशन के बीच समय अंतराल, उदाहरण के लिए, समय पर सही सेलुलर घटना को पकड़ने में बाधा डालेगा; इसके अलावा, vitrification प्रक्रिया ब्याज है कि ग्रिड से आरटी पर imaged किया गया है के सेल को अलग कर सकते हैं. यहां तक कि अगर अधिकांश correlative इमेजिंग दृष्टिकोण का मतलब यह हो सकता है कि नमूना ग्रिड को हेरफेर किया जाना चाहिए और एक उपकरण से दूसरे में ले जाया जाना चाहिए, और ग्रिड संदूषण या क्षति के बढ़ते जोखिम के बावजूद, इनाम स्पष्ट है: सेलुलर परिदृश्य के भीतर विशिष्ट घटनाओं या अणुओं को इंगित करने में सक्षम होने के लिए।
जब पूरे सेल इमेजिंग की आवश्यकता होती है, तो अलग-अलग टोमोग्राम सिलाई संभव है बशर्ते लागू की गई कुल खुराक विकिरण क्षति सीमा से अधिक न हो। आमतौर पर, एक ही सेल पर कुछ टोमोग्राम एकत्र करने के लिए जमा खुराक प्राप्त करने योग्य रिज़ॉल्यूशन (109 Gy) पर सीमा से नीचे है और इसलिए, खुराक को कम करने के लिए कोई विशिष्ट रणनीति की आवश्यकता नहीं है, हालांकि यह नमूना- और प्रयोग-निर्भर है। स्पेक्ट्रो-टोमोग्राफी जैसे गहन डेटा संग्रह के मामले में, खुराक को कम करने की वास्तव में आवश्यकता होगी और सुविधाजनक डेटा संग्रह और विशिष्ट प्रसंस्करण रणनीतियों को लागू करने की आवश्यकता होगी।
क्रायो-एसएक्सटी की कई सीमाएं हैं, जिनका उल्लेख यहां किया जाना चाहिए। पहला एक प्रसिद्ध लापता कील है, जो फ्लैट नमूना समर्थन का उपयोग करने के लिए आंतरिक है। केशिका नमूना 180 डिग्री रोटेशन की अनुमति देने का समर्थन करता है अतीत में उपयोग किया गया है और अभी भी कुछ सुविधाओं में उपयोग किया जाता है, लेकिन वे ग्लास अवशोषण और निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग करने के प्रतिबंध के कारण एक गरीब विपरीत जैसी कमियों को भी प्रस्तुत करते हैं। लापता कील के प्रभाव को कम करने का एक तरीका दोहरी झुकाव टोमोग्राफी करना है। यह वास्तव में आजकल मिस्ट्रल बीमलाइन पर संभव है। दूसरी सीमा इस तरह के माइक्रोस्कोप में उपयोग किए जाने वाले फ्रेस्नेल ज़ोन प्लेट लेंस द्वारा निर्धारित की जाती है। यह लेंस अंतिम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने योग्य और क्षेत्र (डीओएफ) की गहराई को सेट करता है, दोनों कसकर संबंधित हैं। इसका तात्पर्य यह है कि रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने से डीओएफ कम हो जाएगा जबकि सेल की मोटाई अक्सर बड़ी होगी। उदाहरण के लिए, एक 40 एनएम लेंस में सिद्धांत रूप में 3 μm का एक DoF और 24.4 एनएम आधा पिच का रिज़ॉल्यूशन होगा। संकल्प और डीओएफ के बीच समझौता इसलिए रणनीतिक है और लेंस की पसंद सेल30,31 के प्रकार पर निर्भर करेगी। अंत में, दुनिया भर में परिचालन टीएक्सएम आदर्श माइक्रोस्कोप होने से बहुत दूर हैं और सैद्धांतिक अपेक्षाओं तक पहुंचने के लिए ऑप्टिकल सिस्टम में सुधार करने के प्रयास किए जा रहे हैं। अंत में, पुनर्निर्मित संस्करणों के विज़ुअलाइज़ेशन और विभाजन को विशिष्ट सॉफ़्टवेयर टूल 25,32,33,34 के साथ किया जा सकता है।
संक्षेप में, क्रायो-एसएक्सटी इमेजिंग कोशिकाओं को मात्रात्मक रूप से मध्यम रिज़ॉल्यूशन (25-30 एनएम हाफ पिच) और सांख्यिकीय संख्याओं (प्रति दिन कुछ दसियों टोमोग्राम) में अनुमति देता है। यह विशिष्ट परिस्थितियों में ऑर्गेनेल के संगठन, वितरण और आयाम को प्राप्त करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, रोगज़नक़ संक्रमण या बीमारियों के दौरान, सटीक समय बिंदुओं पर या विशेष उपचार के बाद। इसलिए, यह अधिक सामान्य इलेक्ट्रॉन और दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयोगी पूरक जैविक इमेजिंग तकनीक है, उनमें से प्रत्येक नमूना आयामों और संकल्प की एक विशिष्ट श्रृंखला से निपटता है। क्रायो-एसएक्सटी का उपयोग अक्सर दृश्यमान प्रकाश प्रतिदीप्ति को शामिल करने वाले कॉरिलेटिव दृष्टिकोणों में किया जाता है, लेकिन अन्य क्रायो कोरिलेटिव रणनीतियां भी संभव हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को यूरोपीय आयोग क्षितिज 2020 iNEXT-डिस्कवरी परियोजना और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्क्लोडोस्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 75439 के तहत धन प्राप्त हुआ है।
Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |