Vi beskriver metoder til at undersøge TGF-β2-induceret EndMT i endotelceller ved at observere cellemorfologiændringer og undersøge udtrykket EndMT-relaterede markørændringer ved hjælp af immunfluorescensfarvning. CRISPR/Cas9 genredigering blev beskrevet og brugt til at nedbryde genet kodning Snail at undersøge sin rolle i TGF-β2-induceret EndMT.
Som svar på specifikke eksterne signaler og aktivering af visse transskriptionsfaktorer kan endotelceller differentiere sig til en mesenchymal-lignende fænotype, en proces, der kaldes endotel til mesenchymal overgang (EndMT). Nye resultater har antydet, at EndMT er kausalt forbundet med flere menneskelige sygdomme, såsom fibrose og kræft. Desuden kan endotel-afledte mesenchymale celler anvendes i vævsgendannelsesprocedurer, da de kan differentieres yderligere i forskellige celletyper (f.eks. osteoblaster og chondrocytter). Således kan den selektive manipulation af EndMT have klinisk potentiale. Ligesom epitel-mesenchymal overgang (EMT), endmt kan være stærkt induceret af den udskillede cytokin omdanne vækstfaktor-beta (TGF-β), som stimulerer udtryk for såkaldte EndMT transskription faktorer (EndMT-TFs), herunder Snail og Slug. Disse EndMT-TF’er derefter op-og nedregulere niveauerne af mesenchymale og endotelproteiner, henholdsvis. Her beskriver vi metoder til at undersøge TGF-β-induceret EndMT in vitro, herunder en protokol til at studere den rolle, som bestemte TF’er i TGF-β-induceret EndMT. Ved hjælp af disse teknikker fremlægger vi dokumentation for, at TGF-β2 stimulerer EndMT i murin pancreas mikrovaskulære endotelceller (MS-1 celler), og at den genetiske udtømning af Snegl ved hjælp af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9)-medieret genredigering, ophæver dette fænomen. Denne tilgang kan tjene som model til at afhøre potentielle modulatorer af endotelbiologi og kan bruges til at udføre genetiske eller farmakologiske skærme med henblik på at identificere nye regulatorer af EndMT med potentiel anvendelse i menneskelig sygdom.
Endotel til mesenchymal overgang (EndMT) er et multistep og dynamisk biologisk fænomen, der har været forbundet med forskellige fysiologiske og patologiske processer1,2. Ved EndMT mister endotelceller gradvist deres endotelegenskaber, mens de erhverver mesenchymale egenskaber3; således tæt komprimeret og velorganiseret endotelceller differentiere sig til aflange mesenchymal-lignende celler. Morfologiske ændringer i EndMT falder sammen med ændringer i udtrykket af visse gener og proteiner. Generelt falder ekspressionen af proteiner, der opretholder endotelegenskaber, herunder vaskulær endotel (VE)-cadherin, blodplade/EF-vedhæftningsmolekyle-1 (CD31/Pecam-1). Samtidig akkumuleres proteiner relateret til mesenchymale funktioner, såsom α-smooth muskel actin (α-Sma) og glat muskelprotein 22α (Sm22α). Nye resultater har vist, at postnatal EndMT bidrager til udviklingen af menneskelige sygdomme, såsom kræft, hjertefibrose, lungepulsåren hypertension (PAH), åreforkalkning (AS), organfibroseosv. 2,4,5,6,7. En dybere forståelse af de underliggende mekanismer i EndMT, og hvordan man styrer EndMT-processen, vil give nye terapeutiske metoder til EndMT-relaterede sygdomme og regenerativ medicin.
TGF-β er en af de vigtigste EndMT-inducere, og andre kendte involverede faktorer omfatter Wnt /β-catenin, Notch og nogle inflammatoriske cytokiner1. Da den cellulære kontekst er nøglen til svar udløst af TGF-β, er samspillet mellem TGF-β med andre EndMT-promoveringssignaler relevant for TGF-β at fremkalde et EndMT-svar. Ved aktivering af TGF-β celleoverfladetype I og type II serin/threonine kinase receptorer aktiveres den intracellulære kanoniske Smad-vej. TGF-β receptor-medieret fosforlateret Smad2/3 danner heteromeriske komplekser med Smad4, der omfordeler til kernen, hvor de opregulerer udtrykket af EndMT-relaterede transskriptionsfaktorer. I lighed med epitel-mesenchymal overgang (EMT), transskription faktorer som Snail, Slug, Twist, Zeb1 og Zeb2 er induceret af TGF-β signalering og bidrage til genprogrammering i EndMT8.
Snegl er ofte blevet identificeret som en nøglefaktor i EndMT. Snail binder sig til initiativtageren til gener, der kodper cellecelle vedhæftningsproteiner og undertrykker deres transskription, hvilket opvejes af forbedringen af udtrykket af mesenchymale proteiner9. Endotelceller omfatter en meget heterogen population, og den relative indflydelse af forskellige ekstracellulære stimuli på EndMT kan variere mellem endotelcellekontekster eller celletyper10. På grund af dets ligheder med EMT er nogle metoder nyttige til at undersøge begge mekanismer EMT og EndMT8. I denne forbindelse understreger EMT International Association (TEMTIA) kraftigt behovet for komplementære teknikker til i sidste ende at påvise forekomsten af EMT/EndMT11.
Her beskriver vi en metode til at overvåge og visualisere TGF-β-induceret EndMT-proces. Immunfluorescensfarvning giver de grundlæggende oplysninger om udtryksændringer i målrettede proteiner/markører, der bruges som indikatorer for, om EndMT-processen forekommer. Derudover kan immunfluorescens farvning visualisere lokalisering af proteiner / markører og cellemorfologi. For at studere den potentielle aktivitet af specifikke TF’er (eller andre opstrøms- eller downstream-regulatorer), der er involveret i TGF-β medieret EndMT, beskriver vi en protokol, der bruger grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) genredigering til at nedbryde specifikke gener fra celler ved hjælp af TF Snail som et eksempel. Cas9 er en dobbelt RNA-guidet DNA-endonuklease, der genkender og kløver sekvenser, der supplerer CRISPR-sekvenser i bakterie12. CRISPR/Cas9-systemet anvendes i øjeblikket i vid udstrækning, fordi det letter genteknologi in vitro og in vivo13. Instrueret af en enkelt guide RNA (sgRNA), ectopically udtrykt Cas9 genererer en dobbelt streng pause på en forudvalgt målretning sekvens i et bestemt gen locus. Ikke-homolog endeføjning (NHEJ) finder sted for at reparere Cas9-inducerede strengbrud via tilfældige nukleotidindføringer eller sletninger, hvilket fører til forstyrrelse og inaktivering af det målrettede gen. Vi beskriver detaljeret metoder til design af selektive sgRNA’er og generering af lentivirale kompatible vektorer, der indeholder de designede sgRNA’er. Som følge heraf kan stabile genforarmede endotelceller genereres på en effektiv og pålidelig måde.
I denne undersøgelse brugte vi murin pancreas mikrovaskulære endotelceller (MS-1)14 som et modelsystem til at undersøge TGF-β2-induceret EndMT-processen. Vores tidligere undersøgelse viste, at Snail er den vigtigste transskriptionsfaktor øget med TGF-β2, hvormed EndMT induceres i MS-1 celler15. Ved CRISPR/Cas9-genredigering for at ophæve Snail-ekspression i MS-1-celler kunne TGF-β2 ikke mægle i EndMT. Denne arbejdsgang kan anvendes til at studere andre (formodede) EndMT-relaterede gener.
Forståelse af endmt-mekanismen er afgørende for at modulere denne proces og målrette EndMT-relaterede sygdomme. Her beskrev vi metoder til at udføre en TGF-β-induceret EndMT-analyse og afhøre rollen som EndMT-TF Snail i TGF-β-udløst EndMT ved at udføre CRISPR/Cas9-medieret stabil genudtømning af snegl fra celler. Udtømningen af Sneglen ved hjælp af CRISPR/Cas9-metoden ophævede med succes TGF-β2-drevet EndMT i MS-1-celler (Figur 3C). For at undersøge virkningerne af cytokiner, som TGF-β, på EndMT, blev ECs udsat for cytokiner, og derefter blev forekomsten af EndMT vurderet i henhold til morfologiske ændringer og endotel- og mesenchymal markørudtryksændringer i celler. TGF-β2 stærkt induceret EndMT i MS-1 celler ledsaget af en stærk stigning i udtrykket af transskription faktor Snail. EndMT-TF’erne, der er fremkaldt af TGF-β, kan variere alt efter art eller vævsspecifik endotelcelletype. For eksempel observerede vi, at Snail, men ikke Slug, blev signifikant reguleret af TGF-β i MS-1-celler, mens både snegle og snegle i menneskelige navlestrengs-endothelialceller (HUVECs) øges efter eksponering for TGF-β20.
Vi vurderede omfanget af EndMT-processen på to måder ved at undersøge cellemorfologiændringer og derefter ved at undersøge ændringer i EndMT-relaterede markører udtryk. Efter TGF-β eksponering i 3 dage gennemgik celler endmt med konsekvente morfologiske variationer og ændringer i udtrykket af EndMT-relaterede markører. Ud over den immunfluorescens farvning, vi udførte her, kan markørvariationer også overvåges ved vestlig blotting på proteinudtryksniveau eller ved qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) vedgenniveauerne 21. Ud over disse to tids- og omkostningsbesparende metoder, som vi viste i denne protokol, er der andre metoder til at undersøge EndMT. Hvis du f.eks. udfører transskriptionsanalyse (ved RNA-sekventering eller qPCR) for at sammenligne udtryksniveauerne for endotel- og mesenchymale-relaterede gener mellem behandlede celler ogkontrolceller,kan du præcist vurdere EndMT22,23. Derudover indebærer EndMT ofte et stabilt tab af barrierefunktion, som kan vurderes ved impedansspektroskopi24. Desuden kan yderligere dokumentation for endmt-afledte cellers erhvervelse af stamcellelignende egenskaber undersøges. For eksempel kan EndMT mesenchymal-lignende celler under særlige kulturforhold differentieres yderligere i osteoblaster, chondrocytter, adipocytter eller (myo)fibroblaster. Derfor er yderligere analyse for at bekræfte differentieringen i forskellige celletyper, der tilhører mesoderm-slægten (dvs. genekspression og matrixfarvning), nyttig til påvisning af endmt-afledte cellers multipotente karakter. Endelig er EndMT-vurderingsmetoderne ikke begrænset til in vitro-undersøgelser, men kan ekstrapoleres for at undersøge forholdet mellem EndMT og visse sygdomme in vivo eller i ex vivo-organer. I den forstand udvides brugen af endotelspecifikke sporingsstrategier for afstamning bredt til EndMT-relateret forskning25.
For at undersøge Snails rolle under EndMT blev CRISPR/Cas9-genredigering i denne undersøgelse brugt til at slå dette gen ud. Dataene viste, at TGF-β2 ikke kunne mægle EndMT i Snail mangelfuld MS-1 celler. Denne observation viste, at Snegl er afgørende for TGF-β2 induceret EndMT i MS-1 celler. Vi brugte en uafhængig U6-drevet sgRNA-udtrykskassette til at introducere specifikke sgRNA’er til Cas9 for at målrette snail. Ud over denne metode beskrev Ran et al.26 en anden strategi for kloning af sgRNA oligos-sekvensen i Cas9-stilladset for at generere en konstruktion, der indeholder både Cas9 og gRNA’er. Nye tilgange gør det muligt for CRISPR/Cas at indarbejde yderligere funktioner. For eksempel kan dobbelt eller tredobbelt knockouts opnås ved at levere flere sgRNA’er i celler, der udtrykker Cas927. Den manipulerede Cas13 protein mål og fordøjer RNA molekyler uden at forstyrre endogene DNA28. Udover at slå gener ud med CRISPR/Cas, kan korte hårnåle-RNA’er (shRNA’er) bruges som alternativer til at slå målrettet genekspression29ned. For alle CRISPR/Cas-genredigeringsmetoder bør der altid tages hensyn til kavalergang uden for målet. Derudover fortyndes små forstyrrende RNA’er (siRNA’er) forbigående stilhedsgenudtryk, og siRNA-koncentrationen fortyndes med celledeling30. Begge disse metoder undertrykker delvist målrettet genekspression. I modsætning hertil bruges ektopisk genekspression også til at verificere genfunktion under EndMT/EMT31. Denne tilgang kan afgøre, om opreguleringen af et gen er tilstrækkelig til at fremkalde en EndMT-respons. Derfor er der i øjeblikket en lang række tekniske strategier, der kan bruges til at identificere og verificere potentielle regulatorer af EndMT. Desuden kan transskriptionsanalyse være en god mulighed i identifikationen og omfattende analyse af EndMT-relaterede tilsynsmyndigheder. Vi anbefaler, at du bruger forskellige komplementære tilgange til at undersøge gradueringen af EndMT.
Sammenfattende introducerede vi en arbejdsgang for at identificere faktorer, der kan spille funktionelle roller under TGF-β-induceret EndMT. Denne metode kan også bruges til at undersøge, om andre stimuli (dvs. cytokiner, vækstfaktorer, mekaniske stimuli, cellecelleinteraktioner) kan modulere EndMT og samspillet mellem TGF-β med andre stimuli. Derudover fremhævede vi en tilgang ved hjælp af CRIPSR / Cas-genredigering for at belyse, om et bestemt gen er påkrævet for TGF-β-induceret EndMT. For at illustrere denne metode brugte vi den stærke EndMT-inducer TGF-β2 i MS-1-celler, men protokollerne kan tilpasses andre cytokiner og andre celletyper. Vi forventer, at denne detaljerede protokol, der er beskrevet, vil tjene som et springbræt til fremtidige EndMT-relaterede undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen blev støttet af CGC.NL og det hollandske kardio vaskulære forskningsinitiativ: Dutch Heart Foundation, den hollandske sammenslutning af medicinske universitetscentre, den nederlandske organisation for sundhedsforskning og -udvikling og Royal Netherlands Academy of Sciences Grant tildelt Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM støttes af det kinesiske stipendieråd. GSD støttes af et trampolintilskud fra AFM-Telethon [22379], FOP Italia og et tilskud fra La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |