Flux de travail et outils pour le criblage de fragments cristallographiques au Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

Le criblage de fragments cristallographiques au Helmholtz-Zentrum Berlin est effectué à l’aide d’un flux de travail avec des bibliothèques de composés dédiées, des outils de traitement des cristaux, des installations de collecte de données rapides et une analyse de données largement automatisée. Le protocole présenté vise à maximiser le résultat de telles expériences pour fournir des points de départ prometteurs pour la conception de ligands basés sur la structure en aval.

Abstract

Le criblage de fragments est une technique qui aide à identifier des points de départ prometteurs pour la conception de ligands. Étant donné que les cristaux de la protéine cible sont disponibles et présentent des propriétés de diffraction des rayons X à haute résolution reproductibles, la cristallographie est l’une des méthodes les plus préférées pour le criblage des fragments en raison de sa sensibilité. De plus, c’est la seule méthode fournissant des informations 3D détaillées sur le mode de liaison du fragment, ce qui est vital pour l’évolution ultérieure des composés rationnels. L’utilisation systématique de la méthode dépend de la disponibilité de bibliothèques de fragments appropriées, de moyens dédiés pour manipuler un grand nombre d’échantillons, de lignes de faisceau synchrotron de pointe pour des mesures de diffraction rapides et de solutions largement automatisées pour l’analyse des résultats.

Ici, le flux de travail pratique complet et les outils inclus sur la façon de mener le criblage de fragments cristallographiques (CFS) au Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) sont présentés. Avant ce flux de travail, les conditions de trempage des cristaux ainsi que les stratégies de collecte de données sont optimisées pour des expériences cristallographiques reproductibles. Ensuite, généralement dans une procédure d’un à deux jours, une bibliothèque axée sur le SFC de 96 membres fournie sous forme de plaques prêtes à l’emploi séchées est utilisée pour tremper 192 cristaux, qui sont ensuite refroidis instantanément individuellement. Les expériences de diffraction finales peuvent être réalisées en une journée sur les lignes de faisceau supportées BL14.1 et BL14.2 de montage robotisé sur la bague de stockage d’électrons BESSY II exploitée par le HZB à Berlin-Adlershof (Allemagne). Le traitement des données cristallographiques, le raffinement des structures protéiques et l’identification des hits sont rapides et largement automatisés à l’aide de pipelines logiciels spécialisés sur des serveurs dédiés, nécessitant peu d’entrée d’utilisateur.

L’utilisation du flux de travail du SCF au HZB permet des expériences de dépistage de routine. Il augmente les chances de succès de l’identification des coups de fragments comme points de départ pour développer des liants plus puissants, utiles pour des applications pharmacologiques ou biochimiques.

Introduction

La première étape du développement de médicaments consiste à examiner les composés par rapport à une cible d’intérêt. Traditionnellement, de grandes bibliothèques de composés de l’ordre de 100 000 à 1 000 000 d’entrées sont utilisées dans des tests biochimiques à haut débit dans l’industrie pharmaceutique. Cette stratégie a été complétée par la conception de médicaments à base de fragments (FBDD), une méthode plus récente qui a connu une forte augmentation au cours des 20 dernières années et est devenue une stratégie courante pour générer des candidats principaux de haute qualité en raison de plusieurs avantages inhérents de la méthode^1. Le terme « fragment » désigne une petite molécule organique contenant généralement moins de 20 atomes non hydrogène ou lourds (AG). Ainsi, un fragment est significativement plus petit que les molécules médicamenteuses ou de type plomb (généralement moins de 30 HAs) explorées dans le criblage conventionnel à haut débit. Les fragments sont des liants à faible affinité. Cependant, par rapport aux molécules plus grandes, les fragments sont plus polyvalents, car même une petite collection d’entre eux peut mieux représenter l’espace chimique respectif des molécules de même taille². De plus, l’évolution du criblage de fragments dans les molécules de plomb est considérablement plus efficace que l’optimisation de molécules déjà plus grosses^2,3,4,5. Cela signifie qu’en attendant une sensibilité suffisante de la détection, le criblage des fragments peut être utilisé efficacement et donne des points de départ de haute qualité pour une évolution ultérieure des composés. Plusieurs méthodes biophysiques peuvent être appliquées pour le criblage de fragments, les plus populaires étant la résonance magnétique nucléaire, la cristallographie aux rayons X, la résonance plasmonique de surface et les essais de décalage thermique. Ces méthodes sont utilisées de manière parallèle ou séquentielle, dans le but d’augmenter la confiance dans les résultats et de réduire le nombre de faux positifs ou de faux négatifs, respectivement. Cependant, une étude comparative⁶ menée récemment suggère que les cascades de dépistage séquentielles doivent être évitées en raison du faible chevauchement entre les différentes méthodes.

La cristallographie aux rayons X est une méthode bien établie pour la détermination de la structure au détail atomique mais a récemment été également développée comme outil à des fins de criblage^7,8. Comme les cristaux de protéines tolèrent des concentrations élevées de fragments (p. ex., 100 mM), le criblage de fragments cristallographiques (SFC) peut concurrencer d’autres méthodes biophysiques de criblage des fragments ou même les surpasser comme méthode de criblage de première étape^6,9. Cependant, une condition préalable essentielle pour le SFC est un système de cristallisation validé de la protéine cible délivrant de manière reproductible des cristaux avec des propriétés de diffraction à une résolution considérablement élevée, généralement supérieure à 2 Å.

Un avantage exclusif du CFS par rapport à toutes les autres méthodologies de criblage de fragments est la fourniture d’informations 3D détaillées sur le mode de liaison des fragments identifiés. Cette information structurelle est absolument cruciale pour l’optimisation rationnelle des hits de fragments aux liants d’affinité plus élevée. Les stratégies d’élaboration établies se développent, fusionnent et relient les fragments⁵. Ainsi, une efficacité relativement élevée des ligands est fournie dès le début, et l’introduction de groupes inutiles ou spatialement non appropriés peut être évitée, réduisant ainsi les coûts de synthèse chimique. Dans l’ensemble, le SFC présente des avantages inégalés en tant que stratégie de départ pour la conception de médicaments.

Étant donné qu’une cible biologique particulière répond aux exigences élevées du SCF en ce qui concerne la qualité des cristaux, certains facteurs principaux maximisent les chances de réussite de telles campagnes de dépistage. Cela dépend de la qualité de la bibliothèque de fragments utilisée, d’un flux de travail efficace pour mener à bien les expériences avant l’expérience de diffraction, de lignes de faisceau synchrotron avec une automatisation et une vitesse de collecte de données suffisantes, ainsi que des moyens de traitement et d’analyse des données largement automatisés. Ici, le flux de travail complet des expériences de trempage cristallin à l’identification du coup est présenté, de la manière dont il est établi avec succès aux lignes de faisceaux de cristallographie macromoléculaire à BESSY II (Figure 1). L’installation est ouverte aux utilisateurs universitaires et industriels pour la collaboration. En outre, les utilisateurs universitaires des pays de l’UE en dehors de l’Allemagne peuvent directement demander un financement via le projet iNEXT Discovery.

Il existe des prérequis indispensables pour pouvoir lancer une campagne cfs et mener le protocole décrit dans ce travail : il existe des cristaux bien diffractants de la protéine cible qui peuvent être cultivés de manière reproductible en grand nombre, qui sont stables à température ambiante, et qui ont été cultivés à l’aide d’un cocktail de cristallisation sans ingrédients hautement volatils. Une autre condition préalable est l’adéquation du réseau cristallin à l’expérience. Dans un réseau approprié, les sites intéressants de la protéine cible doivent être exposés vers les canaux solvants et donc accessibles. Une autre étape précédente qui est facultative mais néanmoins fortement recommandée pour assurer le succès du flux de travail de la campagne CFS est l’optimisation de la condition de trempage pour l’expérience. Les statistiques de référence de l’état civil sont ici le pouvoir de diffraction du cristal et les indicateurs de qualité des données pertinents, qui sont déterminés au cours de la procédure de mise à l’échelle des données. Les facteurs typiques à optimiser sont la tolérance au DMSO, la concentration tampon et le cryo-protectant. Bien qu’il ne s’agit pas d’une condition préalable stricte, comme indiqué plus en détail ci-dessous, le DMSO en tant que co-solvant peut aider à augmenter la solubilisation des fragments. Les tests typiques devraient inclure un trempage de 0, 3, 6 ou 10% (v / v) de DMSO pendant la nuit. Une augmentation de la concentration tampon à 200 ou 300 mM aide à prévenir la perte de qualité de diffraction due aux effets occasionnels de déplacement du pH découlant des concentrations élevées de fragments à utiliser. Enfin, il est décisif de savoir si et quel cryoprotecteur supplémentaire est nécessaire et s’il peut déjà être inclus dans l’état de trempage. Dans de nombreux cas, cependant, un cryo-protégéant supplémentaire n’est pas nécessaire, car le DMSO lui-même peut agir comme cryo-protégéant. Si c’est le cas, cela permettra d’économiser une étape de manipulation dans l’expérience finale. La plupart des cristaux ont besoin de moins de cryo-protection s’ils sont refroidis au flash sur des boucles de taille appropriée, minimisant ou évitant autant que possible la liqueur mère environnante. Cependant, dans de rares cas, une couche de la liqueur mère est en effet nécessaire pour éviter d’endommager le cristal lors du refroidissement flash.

Le nombre de résultats obtenus dans une campagne cfs dépend non seulement de la druggability de la protéine cible et de la pertinence du réseau cristallin (voir ci-dessus), mais il dépend également de la qualité de la bibliothèque. La qualité de la bibliothèque comprend deux aspects : la sélection des composés pour la bibliothèque et la confection des composés (c.-à-d. sous quelle forme physique ils sont présentés pour l’expérience). Pour la sélection des composés, différentes stratégies peuvent être utilisées. La plupart des conceptions de bibliothèques incluent la maximisation de la diversité chimique des fragments. Un objectif stratégique pourrait être d’inclure la tractabilité chimique des fragments pour la conception de suivi, qui a été appliquée par exemple dans la bibliothèque de positionnement Diamond-SGC-iNEXT¹⁰. Un autre objectif stratégique pour la conception de bibliothèques pourrait être de maximiser la représentation de l’espace chimique disponible dans le commerce des fragments par le clustering basé sur la forme et le pharmacophore, comme l’ont illustré les bibliothèques F2X développées à HZB^11. Plus précisément, la bibliothèque F2X-Universal de 1103 membres et le sous-ensemble représentatif de composés 96 pour les campagnes CFS initiales, appelé écran d’entrée F2X, ont été développés et l’écran d’entrée F2X a été validé avec succès¹¹. L’écran de saisie F2X est le choix principal pour les campagnes CFS à HZB. Par la suite, des campagnes plus importantes peuvent ensuite être menées à l’aide de la bibliothèque universelle F2X ou de la bibliothèque de fragments EU-OPENSCREEN^12, qui compte 1056 membres et qui est également proposée au HZB. À l’heure actuelle, ces bibliothèques sont disponibles gratuitement pour les utilisateurs des lignes de faisceaux de cristallographie macromoléculaire du synchrotron BESSY II à Berlin sur la base d’un contrat de collaboration. Cela s’applique également aux utilisateurs via les propositions iNEXT Discovery. De plus, l’écran d’entrée F2X est à la disposition de tous les scientifiques intéressés sur la base d’un accord de transfert de matériel.

En ce qui concerne la présentation physique d’une bibliothèque, deux approches sont couramment adoptées: les fragments sont soit utilisés comme solutions de stock de DMSO, soit séchés et immobilisés sur des plaques prêtes à l’emploi. Au HZB, l’écran d’entrée F2X et les composés non volatils de la bibliothèque universelle F2X sont présentés comme des composés séchés dans une plaque de cristallisation à profil bas MRC à 3 lentilles et 96 puits. La présentation des fragments immobilisés dans les plaques de cristallisation présente deux avantages vitaux : Tout d’abord, elle permet le transport des plaques de criblage vers le laboratoire à domicile de l’utilisateur. Par conséquent, les étapes de trempage et de manipulation des cristaux du flux de travail présenté ici (étapes 1 à 3) peuvent être effectuées n’importe où. Deuxièmement, une solution sans DMSO peut être utilisée. Les cibles sensibles au DMSO peuvent ainsi être facilement examinées, en conservant en grande partie les taux de succès attendus¹¹. Cependant, le DMSO augmente la solubilité des fragments, il est donc utile de vérifier la tolérance au DMSO d’un système cristallin de choix au préalable, comme indiqué ci-dessus.

Le protocole décrit ci-dessous décrira une expérience typique avec un écran composé 96 tel que l’écran d’entrée F2X. Pour cela, environ 250 cristaux doivent être préparés à temps pour être utilisés fraîchement. Il est fortement conseillé de préparer les trempage pour tous les 96 composés en double. Il est recommandé, mais facultatif, de préparer des simulations d’analyse supplémentaires qui faciliteront plus tard l’analyse des données à l’aide de l’approche d’analyse de densité pan-données (PanDDA) pour l’identification des atteintes^13. Les simulations de trempage sont définies comme des expériences de trempage sur des cristaux de protéines utilisant la même solution de trempage que le fragment trempe pendant le même temps d’incubation, mais aucun fragment n’est présent. Si la solution de trempage est égale à l’état de cristallisation, les cristaux peuvent être récoltés directement à partir de la plaque de cristallisation.

Selon les capacités du changeur d’échantillon robotisé, différents formats de rondelle peuvent devoir être utilisés. À l’heure actuelle, les échantillons pour la ligne de faisceau BL14.1 actionnée par HZB doivent être préparés en format Unipuck, les échantillons pour la ligne de faisceau BL14.2 actionnée par HZB doivent être préparés en format spine puck. Dans ce protocole, la préparation au format Unipuck est supposée.

Protocol

1.Trempage des cristaux

1. Prenez la plaque de criblage (ici, une plaque d’écran d’entrée F2X, Figure 2)du congélateur -20 ° C et placez-la sur le banc / table pendant environ 30 min pour la préchauffer à la température ambiante, évitant ainsi l’humidité de condensation.
2. Disposez le lieu de travail avec deux microscopes étroitement disposés et tous les outils nécessaires(Figure 3A). Les matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.
3. Choisissez 3-4 boucles de la taille appropriée pour le transfert des cristaux à tremper et placez-les près des microscopes.
4. Remplissez les cavités de la plaque de verre avec de l’eau désionisée ou distillée.
5. Préparer 5 mL de solution de trempage.
6. Ouvrir le sac de la plaque de criblage préchauffée à température ambiante.
7. Retirez le couvercle et la feuille de la plaque de criblage, tout en gardant la plaque placée sur le banc / la table.
8. Décanter les 5 mL de solution de trempage dans le réservoir de réactif.
9. Remplissez chacun des 96 réservoirs avec 40 μL de solution de trempage à l’aide de la pipette à 12 canaux.
10. Placez le cadre EasyAccess sur le dessus de la plaque de filtrage et fixez-le avec les pinces incluses en les faisant glisser sur les côtés gauche et droit de l’appareil.
    REMARQUE: Le cadre EasyAccess est un dispositif spécial pour la manipulation de plusieurs cristaux, qui a été développé au HZB¹⁴. Il permet un accès facile à chaque puits en déplaçant les tuiles mobiles tout en protégeant les autres puits de l’évaporation.
11. Placez la plaque de criblage (y compris le cadre EasyAccess) sous le premier microscope et la plaque de cristallisation, y compris les cristaux à tremper sous le deuxième microscope.
12. Faites glisser bien ouvert A1 de la plaque de criblage en déplaçant la tuile de verre acrylique respective du cadre EasyAccess soit avec un doigt ou l’outil de stylo fourni.
13. Ajouter 0,4 μL de solution de trempage du réservoir au puits contenant le fragment (lentille supérieure gauche) à l’aide d’une pointe de pipette fraîche. Vérifiez au microscope que la goutte recouvre le fragment séché afin qu’il puisse se dissoudre.
    REMARQUE: Alternativement, cette étape peut être effectuée à l’aide d’un robot de pipetage avant l’assemblage du cadre EasyAccess. De cette façon, les gouttes de trempage de tous les puits pourraient être placées dans une procédure automatique. Cependant, les auteurs recommandent d’ajouter la solution de trempage directement avant l’étape de trempage comme décrit pour s’assurer que le fragment se solubilise lentement et en présence du cristal. Cela évite que le cristal éprouve un choc soudain lors du transfert à une goutte avec une concentration élevée de fragments.
14. Sous le deuxième microscope, ouvrir la feuille d’étanchéité de la plaque de cristallisation à l’un des puits qui contient les cristaux cibles.
15. Transférer deux cristaux à l’aide d’une boucle de taille appropriée montée sur la baguette de cristal vers le puits A1 de la plaque de criblage sous le premier microscope.
16. Lavez la boucle dans la plaque de verre préparée et séchez-la en touchant doucement le tissu. Faites-le après chaque transfert pour éviter la contamination croisée avec des fragments contenant des solutions de trempage.
17. Utilisez le microscope pour vérifier que les cristaux ont été correctement placés.
18. Passez au puits suivant (p. ex., B1).
19. Répétez les étapes 1.13 à 1.18 avec les 96 puits de la plaque de criblage jusqu’à ce que chaque goutte de trempage contienne deux cristaux.
20. Retirez la plaque de criblage (y compris le cadre EasyAccess) sous le microscope et placez-la sur le banc / la table.
21. Retirez le cadre EasyAccess de la plaque de criblage.
22. Scellez la plaque de criblage avec une feuille d’étanchéité et placez-la dans l’incubateur ou l’armoire de cristallisation, respectivement, où les cristaux ont été cultivés.
23. Incuber pour le temps de trempage optimisé. La nuit est généralement pratique.
24. (facultatif) Préparation d’environ 40 cristaux apo (c.-à-d. trempage simulé)
    1. Prenez une plaque de cristallisation à profil bas MRC 3 lentilles de 96 puits et remplissez deux colonnes avec 40 μL de solution de trempage par puits à l’aide de la pipette à 12 canaux.
    2. Placez le cadre EasyAccess sur le dessus de la plaque de cristallisation et fixez-le avec les pinces incluses en les faisant glisser sur les côtés gauche et droit de l’appareil.
    3. Faites glisser ouvrir le carreau de verre acrylique du puits A1.
    4. Placer 0,4 μL de solution de trempage dans chacune des deux lentilles gauches du puits.
    5. Transférer 2-3 cristaux à chaque goutte. Après chaque transfert, lavez la boucle dans la plaque de verre préparée et séchez en touchant doucement le tissu.
    6. Passer au puits suivant (p. ex. B1).
    7. Répétez les étapes 1.24.4-1.24.6 jusqu’à ce qu’environ 40 cristaux soient prêts pour l’incubation.
    8. Retirez la plaque de cristallisation (y compris le cadre EasyAccess) sous le microscope sur le banc / la table et retirez le cadre EasyAccess.
    9. Scellez la plaque de cristallisation avec une feuille d’étanchéité et placez-la dans l’incubateur ou l’armoire de cristallisation susmentionné.
    10. Incuber en même temps que la plaque de criblage.

2.Récolte des cristaux

1. Sortez la ou les plaques d’incubation de l’incubateur ou de l’armoire, respectivement.
2. Disposez le lieu de travail avec un microscope et tous les outils nécessaires(Figure 3B). Les matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.
3. Préparez un dewar en mousse Unipuck avec 3 couvercles Unipuck (c’est-à-dire des enceintes d’échantillons) et remplissez-le d’azote liquide (LN_2).
   NOTA : Observez les précautions de sécurité appropriées pour travailler avec le LN₂ (c.-à-d. porter des lunettes de sécurité et utiliser un équipement de protection approprié). Il est préférable d’obtenir du LN₂ frais plusieurs fois au cours de la séance afin d’éviter la condensation de l’eau dans la boîte de stockage LN_2. Tout au long de la procédure suivante, assurez-vous que le niveau LN₂ dans le dewar mousse atteint toujours le bord supérieur du dewar. Assurez-vous également que le LN₂ est libre de glace; remplacer fréquemment le LN₂ (p. ex., une fois toutes les 45 minutes), ou le plus tard si la glace commence à s’accumuler. Ensuite, remplissez le deuxième dewar en mousse et transférez-y Unipucks. Videz le dewar en mousse glacée et éliminez la glace résiduelle et l’humidité avec le sèche-cheveux.
4. Retirez la feuille de la plaque de criblage et placez le cadre EasyAccess sur le dessus.
5. Faites glisser vers l’ouverture A1.
6. Récoltez deux cristaux de la goutte et refroidissez-les instantanément dans LN₂ (un par un) en plongeant avec un mouvement vertical rapide dans le LN_2, puis en insérant l’échantillon dans la position appropriée de la rondelle. Prenez des notes pertinentes sur la feuille de suivi de l’échantillon.
7. Étape de cryoprotection (si nécessaire pour les cristaux cibles). Dans ce cas, effectuez cette étape au lieu de 2.6.
   1. Placer 0,4 μL de solution de trempage comprenant un cryo-protection sur la lentille inférieure gauche du puits.
   2. Tirez la boucle avec un cristal monté à partir de la goutte dans la lentille supérieure gauche lentement à travers la solution dans la lentille inférieure gauche tout en gardant le cristal dans la boucle, puis flash-cool dans LN₂. Récoltez deux cristaux de cette façon.
      REMARQUE: Dans les étapes 2.6 et 2.7, assurez-vous que le temps que le cristal est dans la boucle et exposé à l’air est très court. Le plongement (c.-à-d. la chute verticale de l’échantillon dans le dewar rempli de LN₂₎doit être effectué aussi rapidement que possible. Cela garantit une qualité d’échantillon élevée et la prévention des anneaux de glace dans les données. Suivez les échantillons (c’est-à-dire, notez si les cristaux ont des dommages, etc.) pour prioriser l’un ou l’autre duplicata pour les mesures de rayons X suivantes, utilisez le modèle pour cela. Même si les cristaux ont des fissures, des « poils » ou d’autres défauts dus au trempage, ils peuvent toujours être utilisés et doivent toujours être récoltés. Dans le cas où les cristaux se briseraient en plusieurs morceaux, deux des morceaux les plus grands / les plus beaux devraient être récoltés. La figure 5 montre quelques exemples de la façon dont ces cristaux peuvent ressembler. Tous les cristaux montrés ont donné des ensembles de données encore utiles dans la campagne respective¹¹, soulignant qu’il vaut la peine de récolter des cristaux après le traitement de trempage, même si des changements morphologiques substantiels se sont produits.
8. Passez au puits suivant et répétez les étapes 2.5 - 2.6./2.7 jusqu’à ce que les trois rondelles soient remplies.
9. Ajoutez les bases Unipuck sur le dessus des couvercles après les avoir pré-refroidis dans LN₂.
10. Stockez les Unipucks dans des racks de stockage dans un dewar de transport ou un dewar de stockage.
11. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que tous les puits de la plaque de criblage aient été traités.
12. (facultatif) Si des cristaux imbibés de simulacres ont été préparés, récoltez-les de la même manière que celle décrite précédemment.
    REMARQUE: Si deux cristaux pour chacune des 96 conditions de la plaque de criblage pouvaient être refroidis instantanément, il y aura de la place pour 32 cristaux apo imbibés de simulacres, pour remplir les 14 Unipucks.
13. Stockez les Unipucks dans LN₂ jusqu’à la mesure.

3.Collecte de données

1. Transférer les unipucks sur la ligne de faisceau BL14.1. Si des rondelles SPINE ont été utilisées à l’étape 2, transférez-les sur la ligne de faisceau BL14.2.
2. Effectuer des mesures standard sur la ligne de faisceau en utilisant les recommandations spécifiques données ci-dessous. Des détails sur l’installation et le programme de contrôle de l’expérience MXCuBE2 ont été présentés précédemment^15,16. La figure 4 montre l’intérieur des huches expérimentales des lignes de faisceau BL14.1 et BL14.2 ainsi qu’une capture d’écran du logiciel de contrôle MXCuBE2 à la ligne de faisceau BL14.1.
   1. Pour optimiser l’efficacité du temps et le débit, ignorez la collection d’images de test. La distance échantillon-détecteur sera fixée à une valeur qui convient à la limite de résolution supérieure du système cristallin déterminée lors d’expériences antérieures. Si la stratégie de collecte de données n’a pas été optimisée au préalable, collectez 1800 images de 0,2 degré chacune avec un temps d’exposition de 0,1 s par image.
   2. Idéalement, testez la stratégie de collecte de données dans des expériences antérieures en utilisant des cristaux apo imbibés de simulacres. Pour les groupes d’espace à symétrie plus élevée, 1200 images ou même 900 images (c’est-à-dire 240° ou 180°, respectivement) donneront déjà des ensembles de données complets avec de bonnes statistiques, indépendamment de l’angle de départ de la collecte de données.
      REMARQUE : une redondance plus élevée et un découpage plus fin peuvent fournir une qualité de données supérieure¹⁷. Cependant, l’utilisation de cette stratégie « assez mais pas plus » proposée ici est un excellent compromis entre la qualité, le temps de collecte des données, ainsi que les exigences de calcul pour l’analyse ultérieure. De la manière décrite, 200 collectes de données en 24 heures sont bien possibles aux lignes de faisceau BL14.1 et BL14.2. Néanmoins, les échantillons doivent être classés par ordre de priorité.
   3. Collectez d’abord les ensembles de données de diffraction pour un échantillon par condition de fragment, en fonction de la priorisation à l’étape 2.6./2.7 (c.-à-d. collectez les données pour le doublon le plus prioritaire).
   4. Pour les expériences de la section 3.2.3 où la collecte de données a échoué, où la diffraction a été perdue ou des anneaux de glace importants se sont produits, recueillir des données pour le deuxième échantillon en double de l’état de fragment respectif.
   5. Recueillir des ensembles de données de diffraction de cristaux apo (s’ils sont préparés conformément aux étapes 1.24 et 2.12).
   6. Collectez les jeux de données de diffraction des doublons restants de chaque condition de fragment.
   7. Dans le programme MXCuBE2, faites correspondre les identificateurs de jeu de données d’une campagne cfs au modèle suivant : --[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (par exemple, MyProtein-F2XEntry-B05a, où « B05 » signifie le puits (c.-à-d. l’état du fragment à l’écran) et le « a » suivant pour le premier doublon).)

4.Traitement des données

1. Pour l’analyse des données de la campagne CFS, utilisez FragMAXapp, une solution Web pour contrôler une analyse multiplex pour le traitement de l’auto-raffinement et de l’évaluation panDDA des données CFS¹⁸ (Lima et al. FragMAXapp, données inédites). Dans la version FragMAXapp déployée à HZB, les programmes / pipelines suivants sont disponibles: XDSAPP^19,Xia2-DIALS et Xia2-XDS^20,fspipeline^7,DIMPLE^21,Phenix LigFit^22,PanDDA^13,23. Utiliser un modèle d’entrée bien affiné de la protéine cible comme intrant pour le raffinement automatique; sinon, effectuez un raffinement méticuleux d’un cristal imbibé de simulacre haute résolution qui a été collecté pendant la campagne.
   REMARQUE: Un élément clé pour l’identification des résultats est PanDDA. Les détails sont expliqués dans les publications^{respectives 13,23}. En bref, PanDDA calcule automatiquement les cartes de densité électronique d’un ensemble d’ensembles de données dans une campagne CFS. Ceux-ci sont ensuite supposés en tant que conditions de fragment non contraignantes et moyenncés pour générer ce que l’on appelle le modèle d’état fondamental. Le modèle d’état fondamental est ensuite utilisé pour dériver les écarts locaux entre chaque carte de densité électronique et la carte d’état fondamental, en utilisant des scores Z associés au voxel. Ensuite, pour les zones de scores Z élevés, une soi-disant carte PanDDA est créée par soustraction affinée de la densité de l’état fondamental de la carte respective. Cela améliore grandement la visibilité des événements de liaison de fragment.
2. Pour maximiser les résultats de PanDDA, utilisez une approche en deux étapes. Tout d’abord, effectuer une exécution PanDDA (pandda.analyse) avec des paramètres standard. Même si des cristaux imbibés de simulacres ont été collectés, leur identité ne sera pas incluse en tant que paramètre (ce qui est néanmoins possible) afin de permettre une génération impartiale du modèle d’état fondamental par PanDDA à partir de toutes les données disponibles. Ensuite, les données de sortie sont évaluées par l’utilisateur via une inspection dite PanDDA dans Coot²⁴. Ici, il convient de noter les coups avec une confiance relativement élevée, concluant la première étape.
3. Deuxièmement, réexécutez l’étape pandda.analyse en excluant les résultats préliminaires (déterminés dans la première étape) du modèle d’état fondamental via l’option de ligne de commande --exclude_from_characterisation=" ». De plus amples détails sont décrits sur les pages d’aide de PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). De cette façon, les jeux de données qui sont des résultats clairs et qui obscurciraient donc le modèle d’état fondamental s’ils étaient inclus ne sont pas pris en compte. Cela conduit à un modèle d’état fondamental amélioré et donc à de meilleurs résultats dans l’ensemble. Enfin, une inspection panDDA approfondie est effectuée pour compléter l’identification du touché.
   Remarque : FragMAXapp inclut également une option de sortie pour enregistrer les états liés modélisés ou préparer des données pour la soumission PDB, pour plus de détails, voir les pages Web FragMAX (https://fragmax.github.io/).

Results

Dans le cadre des campagnes de validation de l’écran d’entrée F2X¹¹précédemment signalées, trois campagnes ont été menées à la ligne de faisceau BioMAX au MAX IV et une campagne a été menée à la ligne de faisceau BL14.1 à HZB. Dans cette dernière campagne, un ensemble particulier de conditions d’écran d’entrée F2X utilisant une condition de trempage qui ne contenait pas de DMSO a été examiné contre le complexe protéine-protéine de la levure Aar2 et le domaine de type RNaseH de la levure Prp8 (AR). L’ensemble de conditions sélectionné comprend les résultats qui ont été trouvés dans une campagne antérieure de l’écran d’entrée F2X contre AR dans une condition de trempage contenant du DMSO¹¹( c.-à-d. dans la campagne effectuée au HZB, ces résultats ont été re-filtrés en l’absence de DMSO). La figure 7 montre une vue d’ensemble des résultats obtenus après l’analyse des données avec la combinaison FragMAXapp de XDSAPP pour le traitement, fspipeline pour l’affinement automatique et la recherche de résultats ultérieure à l’aide de PanDDA.

Figure 1: Représentation schématique du flux de travail d’une expérience de criblage de fragments cristallographiques (CFS) en mettant l’accent sur l’environnement spécial au Helmholtz-Zentrum Berlin. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Formulation et emballage de l’écran de saisie F2X. L’écran composé de 96 est disponible sur une plaque à profil bas MRC à 3 lentilles de 96 puits, scellée avec une feuille et emballée sous vide. Les 96 composés de l’écran sont séchés à partir de solutions DMSO dans deux des trois lentilles de chaque puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Photographie de l’établi cfs dans le laboratoire de préparation HZB. Des assemblages d’outils nécessaires pour A)le trempage et pour B)la récolte de cristaux sont affichés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Stations d’extrémité de collecte de données et logiciel de contrôle. A)Photographie du hutch expérimental des lignes de faisceaux HZB-MX BL14.1 (à gauche) et BL14.2 (à droite)¹⁵. B) Capture d’écran de l’interface de contrôle de l’expérience MXCuBE2¹⁶ utilisée au BL14.1 pour la collecte de données de diffraction. Au BL14.2 une interface très semblable est utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.  

Figure 5: Instantanés photographiques de certains échantillons cristallins en milieu cryogénique avant la collecte des données. Ceci illustre la variabilité des morphologies des cristaux après avoir effectué le trempage des fragments et la récolte des cristaux. Les photographies ont été prises sur la ligne de faisceau BioMAX (synchrotron MAX IV, Lund, Suède) pour des échantillons d’AR prélevés là-bas dans le cadre de la validation de l’écran d’entrée F2X^11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Capture d’écran du FragMaxApp¹⁸ installé au HZB pour une analyse pratique des données. Plus de détails dans Lima et al., FragMAXapp, données inédites. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7: Aperçu des résultats de la campagne SCF F2X-Entry vs AR (sans DMSO). Le complexe de protéines AR est montré en vue de dessin animé, avec Aar2 coloré en gris et le domaine de type RNaseH de Prp8 coloré en bleu. Les fragments de la campagne sont colorés en couleurs d’éléments (C - jaune, O - rouge, N - bleu, S - orange, Cl - cyan clair). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Renseignements supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

Discussion

Pour une campagne CFS réussie, il est essentiel de respecter les conditions préalables décrites (voir Introduction). Un système de cristallisation fiable est nécessaire pour la croissance reproductible de nombreux cristaux bien diffractants, et une structure bien raffinée est nécessaire en tant que modèle apo d’entrée pour un raffinement automatisé. Il est également important de vérifier que le site cible sur la protéine (site actif ou zone d’interface) est accessible pour les fragments dans le réseau cristallin. Il est crucial d’optimiser les conditions de trempage au préalable pour s’assurer que le trempage ne détériore pas de manière significative la qualité du cristal. Négliger ces aspects conduira très probablement à une expérience sous-optimale, qui sera d’une utilité limitée et nécessitera, dans le pire des cas, une répétition de l’ensemble de l’expérience.

Le protocole décrit ci-dessus décrit les procédures qui sont suivies au cours d’une campagne standard du SCF. Si toutes les conditions préalables sont remplies, au moins 90% de tous les cristaux trempés doivent afficher une diffraction à haute résolution dans une expérience de diffraction. Si ce n’est pas le cas, les temps de trempage peuvent être raccourcis à quelques heures, voire quelques minutes. En raison de la bonne solubilité de la plupart des fragments, cela devrait suffire pour obtenir des valeurs d’occupation décentes. En outre, une campagne typique du SCF se traduira par un taux de réussite d’environ 10% ou plus. Pour les campagnes de validation de l’écran d’entrée F2X,¹¹ et des campagnes utilisateur en cours avec la même bibliothèque ont été observées des taux de réussite encore plus élevés (20% et plus, données non montrées).

Une mise en garde générale du criblage cristallographique de fragment est la présence des emplacements cristallographiques de contact. Ceux-ci pourraient soit occlure a priori des sites actifs connus (à vérifier avant le dépistage, voir ci-dessus), soit ces sites de contact fournissent aussi souvent des poches et des points chauds où les fragments peuvent se lier. De tels coups de fragments seront des artefacts du réseau de cristallisation et ne se lieront probablement pas à la protéine en solution. Ces événements ont tendance à se produire plus souvent dans les expériences de trempage que dans les expériences de co-cristallisation (probablement en raison des concentrations plus élevées de fragments utilisées dans les expériences de trempage). Cependant, selon l’expérience antérieure, ils ne constituent généralement qu’une petite partie des résultats obtenus. Par exemple, dans la campagne de validation F2X-Entry Screen utilisant l’endothiapepsine (EP) et le complexe protéine-protéine épissosomique de Prp^8RNaseH et Aar2 (AR), la plupart des hits se sont produits dans des sites prometteurs^11. Pour l’EP, 27 des 37 événements de liaison observés ont été localisés dans le site actif (c.-à-d. la fente peptidique de cette protéase). Les 10 événements de liaison à distance comprennent deux événements de liaison exposés aux solvants et huit événements de liaison de contact cristallin (correspondant à cinq résultats uniques). L’exclusion de ces hits de contact cristallin refléterait toujours un taux global de 24% de hits uniques pour la campagne EP. Il est également important de noter que les événements de liaison à distance d’un site actif connu (à l’exception des liants de contact cristallin) pourraient également être intéressants (p. ex., révéler de nouveaux points chauds ou des sites allostériques de la protéine). Pour la campagne AR (dans la même publication), sur les 23 événements de liaison observés, sept étaient situés à des contacts cristallins, un était situé à l’interface directe des deux protéines, sept étaient situés à des sites d’interactions protéine-protéine connus avec d’autres partenaires de liaison du contexte biologique plus large (d’où différentes étapes d’assemblage du spliceosome), huit événements de liaison ont révélé deux points chauds sur AR de fonction encore inconnue et un étant à une surface exposée au solvant de Prp8^RnaseH. Par conséquent, en excluant les événements aux contacts cristallins et le singleton Prp8^RnaseH, le nombre d’événements de liaison potentiellement utiles est de 15 (correspondant à 14 hits uniques), soit un taux de succès de 15,6%. Ces hits peuvent être des points de départ pour la conception de modulateurs d’interaction protéine-protéine ou pour des composés d’outils visant à explorer les deux points chauds Aar2 découverts. Dans l’ensemble, également conformément aux campagnes menées auprès des utilisateurs, seule une partie mineure des résultats dans le criblage des fragments cristallographiques doit souvent être ignorée en tant qu’artefacts. Cependant, cela dépendra aussi largement de la cible.

Si le taux de succès est significativement plus faible, cela peut indiquer l’un des problèmes suivants liés à la protéine cible. Par exemple, dans une campagne du SFC contre une cystéine protéase virale, un taux de succès de seulement 3% a été observé (données non montrées). Il s’est avéré que la protéine utilisée a probablement été modifiée chimiquement dans son site actif. Dans un tel cas, une préparation protéique différente peut résoudre le problème. Si les cristaux sont très intolérants au DMSO, l’écran d’entrée F2X peut également être utilisé sans DMSO, bien que les résultats puissent différer dans une certaine mesure. La plupart des hits obtenus en présence de DMSO apparaîtront également en son absence. Il y aura également quelques coups qui ne peuvent pas être observés en l’absence de DMSO, même s’ils peuvent être observés en sa présence. Et enfin, il y en aura qui n’apparaîtront qu’en l’absence de DMSO.

La difficulté la plus grave se produit si la protéine subit un mouvement d’ajustement induit lors de la liaison de la substance. Très probablement, le réseau cristallin ne tolérera pas le mouvement des protéines et les cristaux se désintègreront. Dans un tel cas, le seul choix est de recourir à la co-cristallisation de la protéine et des fragments. Cela peut cependant conduire à de nouvelles formes cristallines. Par conséquent, une grande partie de l’automatisation de l’ensemble du processus ne fonctionnera plus efficacement. Heureusement, dans la plupart des campagnes du SCF menées au HZB jusqu’à présent, ce genre de problème n’a pas été rencontré. Il se peut que la faible liaison d’un fragment, ne fournisse pas assez d’énergie pour induire un mouvement protéique, en particulier si la conformation cristallisée est stabilisée par des forces d’emballage cristallines.

Une autre limitation sérieuse de la méthode que les auteurs ont rencontrée jusqu’à présent est lorsque le cocktail de cristallisation (et donc la solution de trempage) contient des composés volatils. Ensuite, il devient presque impossible d’effectuer toute la manipulation des cristaux de manière significative.

Différentes protéines peuvent contenir des sites médicamentables dans une plus ou moins grande mesure. Par exemple, les interactions protéine-protéine sont généralement médiées par des surfaces planes étendues qui sont plus difficiles à cibler. Le taux de liaison aux fragments dépendra donc probablement de la structure de la surface moléculaire de la protéine. Dans un cas extrême, une protéine peut ne pas contenir de points chauds de surface appropriés qui servent de sites cibles pour la liaison aux fragments. Ainsi, malgré une expérience méticuleusement réalisée, aucun fragment de frappe ne résultera du criblage. Toutefois, les auteurs n’ont pas encore rencontré une telle situation.

En principe, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, la partie de trempage et de récolte de cristaux d’une campagne cfs peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire équipé pour la manipulation de cristaux. Cela distingue la méthodologie du HZB des autres installations du SCF et peut être un avantage dans certains cas. Par exemple, si les cristaux ne peuvent pas être facilement produits à un autre endroit ou si le déplacement des expérimentateurs est limité (p. ex., dans une situation pandémique mondiale), les utilisateurs du HZB reçoivent donc tout l’équipement (rondelles, outils, cadre EasyAccess, porte-échantillons, etc.) sous forme d’ensemble portatif.

Cependant, les exigences relatives à un grand nombre de porte-échantillons et de capacités de stockage cryogéniques sont encore plus facilement satisfaites dans des installations dédiées au SCF. En outre, la nécessité de la collecte de nombreux ensembles de données de diffraction préconise fortement la localisation de ces installations à proximité des lignes de faisceau qui sont orientées vers un débit d’échantillon élevé. Les lignes de faisceauX I04-1 de la source lumineuse Diamond et l’installation XChem associée au Royaume-Uni^8,25,les lignes de faisceaux MASSIF à l’ESRF en France²⁶ ou l’installation FragMAX à la ligne de faisceau BioMAX au MAX IV en Suède¹⁸en sont des exemples.

À l’avenir, il pourrait être envisagé de concevoir des expériences de SFC sans avoir besoin de manipulation de cristaux. Les premiers progrès dans ce sens ont été signalés. Par exemple, par transfert de liquide acoustique permettant le mélange à la fois des solutions cristallines et des solutions fragmentiques directement sur des porte-échantillons de type maille^27. Une autre approche a été employée pour le ligand-criblage basé sur XFEL. Dans une expérience de démonstration de principe, une boue cristalline a été préparée en lot, et la collecte de données de trempage et de diffraction a été effectuée sur une puce cible fixe de silicium^28. Cependant, ces approches sont encore en cours d’élaboration et loin d’être applicables à un large éventail de cibles protéiques ou réalisables pour les installations du SCF en tant que routine.

Avec le protocole dans ce travail, des instructions détaillées pour mener à bien des campagnes du SCF directement au HZB (et ailleurs) ont été décrites et des conseils généraux et des conseils pratiques utiles pour préparer et mener de telles expériences avec plus de chances de succès ont été donnés. En fin de compte, de meilleures chances et de meilleurs taux de réussite dans le dépistage du SFC contribuent en grande partie à fournir efficacement des points de départ pour le développement en aval de composés d’outils ou de candidats-médicaments.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 et micro ; Pipette L	Eppendorf	EP3123000012
pipette 12 canaux, 100 & micro ; L	Eppendorf	EP4861000791
Séchoir	TH-Geyer	9.106 788
		cristallisation contenant	des cristaux Contient des cristaux à tremper
Incubateur			Fournissant une température constante pour l’expérience de cristallisation, à HZB : 20° ; C
Dual Thickness MicroLoops (LD) de différentes tailles d’ouverture	MiTeGen	diverses, par ex. M5-L18SP-75LD	250 boucles de la taille appropriée nécessaire pour le protocole, peuvent être fournies par HZB  ;
Cadre EasyAccess	HZB		Le cadre EasyAccess est un appareil spécial pour la manipulation de plusieurs cristaux, qui a été développé au HZB (Barthel et al., 2021).
F2X-Entry Screen plate	HZB		Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)
Plaque spot	en verre VWR	MARI1406506
Azote			Au moins une boîte de 5 L remplie
Boîte de stockage d’azote liquide	n.a.n.a.Baguette
à cristaux magnétiques	MiTeGen	M-R-1013198
Microscopes	Leica	n.a.MRC
3 objectifs 96 puits plaque de cristallisation à profil bas	SwissCI	3W96TLP-UVP	Pour cristaux imbibés (en option)
Réservoir de réactifs	Carl Roth	EKT6.1	Volume de 25 ml
Modèle de suivi d’échantillon			https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx
Scalpel	B. Braun	BA825SU
Film d’étanchéité pour plaques de microtitration	GreinerBioOne	676070
Cannes d’expédition de rondelle à étagères (pour Unipucks)	MiTeGen	M-CP-111-065	2 cannes en aluminium ; peut être fourni par la solution de
trempage HZB			Au moins 5 ml sont nécessaires
Solution de trempage comprenant un cryo-protecteur, 150µ ;			Seulement nécessaire si la solution de trempage n’est pas déjà cryo-protectrice
Tissus  ;	Roth (Kimberly Clark Professional)	AA64.1
Dewar de transport (Whartington dry shipper)	MiTeGen	TW-CX100	2 Dewar de voyage pour le stockage des 2 cannes unipuck, ou un dewar de stockage de type VHC35 ou similaire pourrait être utilisé.
Dewars en mousse Unipuck avec couvercle	MiTeGen	M-CP-111-022	deux dewars en mousse spécialement adaptés à la manipulation des unipucks décrits dans le protocol si des palgets SPINE sont utilisés, il peut être nécessaire d’appliquer des dewars en mousse différents.
Kit de démarrage Unipuck	MiTeGen	M-CP-UPSK001	Peut être fourni par le HZB
Unipucks	MiTeGen	M-CP-111-021	14 Unipucks ; peut être fourni par le HZB