हम वेंट्रल साइड से वयस्क माउस के ब्रेनस्टेम को बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। एक लघु माइक्रोस्कोप के साथ एक ढाल-अपवर्तक सूचकांक लेंस का उपयोग करके, कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग वीवो में अवर जैतून तंत्रिका सोमाता की गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
अवर जैतून (आईओ), वेंट्रल मेडुला में एक नाभिक, फाइबर पर चढ़ने का एकमात्र स्रोत है जो सेरिबैलम में प्रवेश करने वाले दो इनपुट रास्तों में से एक है। आईओ लंबे समय से मोटर नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण होने का प्रस्ताव किया गया है और इसकी गतिविधि वर्तमान में सेरिबैलम के मोटर और संज्ञानात्मक कार्यों दोनों की कई परिकल्पनाओं के केंद्र में माना जाता है। जबकि इसके शरीर विज्ञान और समारोह अपेक्षाकृत अच्छी तरह से विट्रो मेंएकल सेल स्तर पर अध्ययन किया गया है, वर्तमान में वहां जीवित जानवरों में IO नेटवर्क गतिविधि के संगठन पर कोई रिपोर्ट कर रहे हैं । यह काफी हद तक आईओ के बेहद चुनौतीपूर्ण शारीरिक स्थान के कारण है, जिससे पारंपरिक फ्लोरोसेंट इमेजिंग विधियों के अधीन करना मुश्किल हो जाता है, जहां ब्याज के क्षेत्र में dorsally स्थित पूरे मस्तिष्क के माध्यम से एक ऑप्टिक पथ बनाया जाना चाहिए।
यहां हम आईओ नेटवर्क से अत्याधुनिक स्तर के कैल्शियम इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं। विधि आईओ के चरम वेंट्रल स्थान का लाभ उठाती है और इसमें कैल्शियम सेंसर GCaMP6s-एनेस्थेटाइज्ड चूहों में आईओ व्यक्त करने के वेंट्रल सतह के संपर्क में आने के लिए गर्दन विसेरा के माध्यम से एक ढाल-अपवर्तक सूचकांक (जीएनएन) लेंस डालने के लिए एक शल्य प्रक्रिया शामिल है। एक प्रतिनिधि कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग सर्जरी के बाद IO न्यूरॉन गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि यह एक गैर-जीवित रहने वाली सर्जरी है और रिकॉर्डिंग संज्ञाहरण के तहत आयोजित की जानी चाहिए, यह जीवन-महत्वपूर्ण ब्रेनस्टेम नाभिक को नुकसान से बचाता है और आईओ में स्थानिक प्रणाली गतिविधि पैटर्न और इनपुट एकीकरण की जांच करने वाले बड़े प्रकार के प्रयोगों का संचालन करने की अनुमति देता है। संशोधनों के साथ इस प्रक्रिया का उपयोग वेंट्रल ब्रेनस्टेम के अन्य, आसन्न क्षेत्रों में रिकॉर्डिंग के लिए किया जा सकता है।
सिस्टम न्यूरोसाइंस का मुख्य लक्ष्य यह समझना है कि न्यूरोनल नेटवर्क के स्थानिक गतिविधि पैटर्न पशु व्यवहार की पीढ़ी में कैसे योगदान देते हैं। इस प्रकार, कैल्शियम-संवेदनशील जांच का उपयोग करने वाली फ्लोरोसेंट इमेजिंग पद्धति पिछले दशक में जीवित जानवरों में न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए एक मुख्य उपकरण बन गई है1,2,क्योंकि यह एकल कोशिकाओं से लेकर मेसोस्केल सर्किटरी तक स्थानिक तराजू में ऐसी गतिशीलता के दृश्य की अनुमति देता है। हाल के वर्षों में, आम दृष्टिकोण जहां सतही मस्तिष्क संरचनाओं (जैसे सेरेब्रल या सेरिबेलर कॉर्टिस) में तंत्रिका सर्किट को पारदर्शी कपाल खिड़की के माध्यम से चित्रित किया जाता है3 को ढाल-अपवर्तक सूचकांक (जीएनएन) लेंस 4 के उपयोग के साथ पूरित किया गया है जो गहरे मस्तिष्कसंरचनाओं में नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा की अनुमति देता है। वर्तमान में उपलब्ध ग्रिन लेंस कई मिलीमीटर गहरी संरचनाओं में पहुंचने की अनुमति देते हैं, जैसे माउस एमिग्डाला, हिप्पोकैम्पस और बेसल गैंगलिया5। हालांकि, वेंट्रल मेडुला में विभिन्न नाभिक जैसे ब्याज के कई क्षेत्र काफी गहरे हैं, उन्हें ग्रिन लेंस पहुंच के चरम पर रखते हैं।
यहां, हम वर्णन करते हैं कि मस्तिष्क के वेंट्रल पहलू के माध्यम से मेडुला की अपेक्षाकृत आसान पहुंच का लाभ उठाकर इस कठिनाई को कैसे दूर किया जाए। वयस्क चूहों का उपयोग करना जहां अवर जैतून (आईओ), वेंट्रल मेडुला में एक नाभिक, कैल्शियम सेंसर GCaMP6s से वायरल रूप से संक्रमित किया गया है, हम सर्जिकल चरणों का वर्णन करते हैं (मूल रूप से खोसरोवनी एट अल में वर्णित विधि से संशोधित। 20076)एनेस्थेटाइज्ड माउस के मस्तिष्क की वेंट्रल सतह पर एक जीईन लेंस रखें। एक लघु माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, हम ऐसे बेहद वेंट्रल मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्डिंग की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं। जबकि प्रक्रिया जरूरी एक गैर-अस्तित्व सर्जरी है और जागते जानवरों में कोई प्रयोग नहीं किया जा सकता है, विधि संवेदी या अन्य अफ़ोषक मार्ग उत्तेजना के संदर्भ में अक्षुण्ण नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा की अनुमति देती है, जो तीव्र स्लाइस तैयारी का उपयोग करके पूर्व वीवो-दृष्टिकोणों पर स्पष्ट लाभ प्रदान करती है।
चूंकि सर्जिकल प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण संरचनाओं (धमनियों, नसों) के साथ गले के क्षेत्र में किए गए ऑपरेशन शामिल हैं, यह आवश्यक है कि यह उच्च स्तरीय सर्जिकल कौशल वाले शोधकर्ता द्वारा आयोजित किया जाता है। निम्नलिखित में, हम प्रक्रिया के कई प्रमुख बिंदुओं पर प्रकाश डालते हैं और टिप्पणी करते हैं; हालांकि, यह याद दिलाया जाना चाहिए कि लिखित सलाह की कोई राशि अनुभव, कौशल, और शोधकर्ता के अंतर्ज्ञान को हटा सकती है।
सर्जरी में सबसे महत्वपूर्ण कदम श्वासनली है। इसमें श्वासनली को काटना, नाक शंकु से इंडुबेशन ट्यूब में आइसोफलुरेन स्विच करना, ट्रेंचिया को छाती की त्वचा तक सुरक्षित करना और श्वासनली और इंडुबेशन ट्यूब को एक साथ बांधना शामिल है। इन सभी कार्यों को दुर्घटनाओं से बचने के लिए सुचारू और तेजी से पूरा किया जाना चाहिए, जैसे अपर्याप्त संज्ञाहरण, श्वासनली में तरल पदार्थ की आमद या इंडीबेशन ट्यूब स्लिप-ऑफ। श्वासनली काटने से पहले प्रोटोकॉल को स्पष्ट रूप से ध्यान में रखना चाहिए।
नकसीर इस सर्जरी में जानवरों की मौत का एक बड़ा कारण है। चूंकि गर्दन क्षेत्र रक्त वाहिकाओं के साथ घना है, इसलिए अनदेखी नसों और धमनियों को काटने से बचने के लिए दृष्टि की रेखा स्पष्ट होने पर ही कटौती की जानी चाहिए। इसलिए, दृष्टि अस्पष्ट मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों को हटा दिया जाना चाहिए, और टूटी हुई केशिकाओं से रक्त को आगे बढ़ने से पहले साफ किया जाना चाहिए।
सर्जरी की शुरुआत से ही जानवर को लंबे समय तक (8 घंटे से अधिक) तक जीवित रखा जा सकता है। हालांकि, सर्जिकल प्रक्रिया को जल्दी से खत्म करना महत्वपूर्ण है, इसलिए पशु शारीरिक स्थिति अच्छी होने पर ब्रेनस्टेम न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए अधिक समय है। एक कुशल शोधकर्ता पूरी प्रक्रिया को 70 मिनट में खत्म कर सकता है।
जबकि विधि वेंट्रल मस्तिष्क सतहों का एक साफ दृश्य प्रदान करती है, दुर्भाग्य से ट्रेकोटॉमी के प्रदर्शन के साथ-साथ गले के क्षेत्र में ऊतक की महत्वपूर्ण मात्रा को हटाने के बिना ऐसा करना असंभव है। इसलिए, जानवर को संज्ञाहरण से जागने की अनुमति नहीं दी जा सकती है। इसके अलावा, भले ही एनेस्थेटिक डिलीवरी के सावधानीपूर्वक समायोजन के साथ कई घंटों तक जानवर को जीवित रखना संभव है, शरीर के तापमान और जलयोजन को बनाए रखना, यह अपरिहार्य है कि लंबे समय तक प्रयोग अंततः जानवरों की स्थिति को कमजोर करने का कारण बनेगा। यह स्थिर रिकॉर्डिंग की अधिकतम अवधि पर विचार करने के लिए शोधकर्ता की विशेषज्ञता पर छोड़ दिया है।
विधि की एक और संभावित सीमा के रूप में यहां वर्णित है कि के रूप में GRIN लेंस मस्तिष्क parenchyma में डाला नहीं है, केवल अपेक्षाकृत सतही न्यूरॉन्स (~ 150-200 μm) की जांच की जा सकती है । जबकि ग्रिन लेंस का शल्य प्रत्यारोपण तकनीकी रूप से संभव है, तीव्र सर्जरी विधि न्यूरॉन्स के लिए ऑक्सीडेटिव तनाव और प्रत्यारोपण के बाद रक्त की उपस्थिति से उबरने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति नहीं है स्वीकार्य से परे छवि गुणवत्ता नीचा होगा ।
उपरोक्त चिंताओं के बावजूद, हमारा मानना है कि यह पहली बार आईओ न्यूरॉन्स के वीवो इमेजिंग में एक विधि प्रस्तुत की गई है। यह संवेदी प्रणालियों से अक्षुण्ण अफ़रार आदानों के साथ-साथ सेरिबेलर न्यूक्लियी और मेसोडिएंसेफेलिक जंक्शन22से संकेतों की उपस्थिति में वीवो में संदर्भ में आईओ न्यूरॉन्स में स्थानिकप्राक्षक गतिविधि की जांच की अनुमति देता है, एक उपलब्धि जो अब तक संभव नहीं हुई है। इस विधि के साथ, आईओ के कार्य की अब संवेदी और ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के संयोजन के साथ अधिक गहराई से जांच की जा सकती है। विशेष रूप से, वोल्टेज इमेजिंग के विकास के साथ (जैसे आईओ 23में वोल्टेज इमेजिंग के लिए हमारी हालिया विधि), हमें उम्मीद है कि प्रस्तुत सर्जिकल विधि कई शोधकर्ताओं को यह जांच करने की चुनौती लेने के लिए प्रेरित करेगी कि आईओ सेरिबेलर कॉम्प्लेक्स स्पाइक्स की पीढ़ी में कैसे योगदान देता है।
The authors have nothing to disclose.
हम वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए OIST के मीडिया सेंटर से एंड्रयू स्कॉट का शुक्रिया अदा करते हैं । इसके अलावा, हम सर्जरी के विकास के साथ उनकी मदद के लिए ह्यूगो Hoedemaker शुक्रिया अदा करने के लिए आंकड़े के लिए चित्र ड्राइंग के साथ उसकी मदद के लिए brainstem और डॉ केविन Dorgans बेनकाब । इसके अलावा, अपनी आवाज पर कथन के लिए साल्वाटोर लाकवा के लिए बहुत धन्यवाद, साथ ही साथ सभी एनआरईएम सदस्यों और पालतू जानवरों कोविड-19 के कठिन समय में भलाई के लिए समर्थन जारी रखने के लिए।
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Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
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IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
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Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |