Injicerbare supramolelekylære polymer-nanopartikelhydrogeler til anvendelse til levering af celler og lægemidler

Summary

Denne protokol beskriver syntesen og formuleringen af injicerbare, supramolekyliske polymer-nanopartikel (PNP) hydrogel biomaterialer. Anvendelse af disse materialer til levering af lægemidler, biofarmaceutisk stabilisering og celleindkapsling og -levering demonstreres.

Abstract

Disse metoder beskriver, hvordan man formulerer injicerbare, supramolekylære polymer-nanopartikel (PNP) hydrogels til brug som biomaterialer. PNP hydrogels består af to komponenter: hydrofobisk modificeret cellulose som netværket polymer og selvsamlede core-shell nanopartikler, der fungerer som ikke-kovalente cross linkers gennem dynamiske, multivalente interaktioner. Disse metoder beskriver både dannelsen af disse selvsamlede nanopartikler gennem nanoprecipitation samt formuleringen og blandingen af de to komponenter til at danne hydrogels med justerbare mekaniske egenskaber. Brugen af dynamisk lysspredning (DLS) og reologi til at karakterisere kvaliteten af de syntetiserede materialer er også detaljeret. Endelig er nytten af disse hydrogels til levering af lægemidler, biofarmaceutisk stabilisering og celleindkapsling og levering demonstreret gennem in vitro-eksperimenter for at karakterisere lægemiddeludslip, termisk stabilitet og celleafregning og levedygtighed. På grund af dets biokompatibilitet, injicerbarhed og milde geldannelsesforhold er dette hydrogelsystem en let justerbar platform, der er egnet til en række biomedicinske applikationer.

Introduction

Injicerbare hydrogels er et nyt værktøj til at levere terapeutiske celler og lægemidler til kroppen på en kontrolleret måde¹. Disse materialer kan være fyldt med medicin eller celler og kan administreres på en minimalt invasiv måde gennem direkte injektion til overfladisk væv eller ved kateter levering til dybe væv. Generelt består injicerbare hydrogeler af vandsvulmede polymernetværk, der krydses sammen af forbigående, fysiske interaktioner. I hvile giver disse crosslinks en solid-lignende struktur til gelerne, men ved anvendelse af tilstrækkelig mekanisk kraft forstyrres disse crosslinks midlertidigt og omdanner materialet til en væskelignende tilstand, der let kan flyde². Det er disse rheologiske egenskaber, der gør det muligt for fysiske hydrogels at forskyde og strømme gennem små nålediametre under^{injektion 3}. Efter injektion, polymer netværk af materialet reformer, gør det muligt at selvhelbrede og hurtigt danne en solid-lignende gel in situ^4,5. Disse strukturer kan fungere som slow-release depoter for lægemidler eller stilladser til vævsregenerering^6,7. Disse materialer er blevet brugt i forskellige applikationer, der omfatter medicin levering teknologi, regenerativ medicin, og immunoengineering^{1,8,9,10,11,12}.

Både naturlige materialer (f.eks. alginat og kollagen) og syntetiske materialer (f.eks. poly(ethylenglycol) (PEG) eller lignende hydrofile polymerer) er udviklet som biokompatible injicerbare hydrogelmaterialer^13,14,15. Mange naturlige materialer udviser variation fra parti til parti , der påvirker reproducerbarheden^4,16. Disse materialer er ofte temperaturfølsomme og hærder ved at nå fysiologiske temperaturer; Håndteringen af disse materialer udgør således yderligere tekniske og logistiske udfordringer¹⁷. Syntetiske materialer giver mulighed for mere præcis kemisk kontrol og fremragende reproducerbarhed, men disse materialer kan undertiden være udsat for negative immunresponser, der begrænser deres biokompatibilitet, et kritisk træk for in vivo terapeutiske applikationer^6,18,19. Nylige bestræbelser har vist, at der er mange komplekse designkriterier involveret i engineering en injicerbar hydrogel materiale, herunder optimering af mekaniske egenskaber, polymer netværk mesh størrelse, bioaktive molekylære signaler, bionedbrydelighed, og immunogenicitet af materialet^{20,21,22,23,24,25,26}. Alle disse faktorer skal overvejes afhængigt af anvendelsen af interesse, hvilket betyder, at en modulær, kemisk tunable platform er ideel til at opfylde en bred bredde af applikationer.

De nuværende metoder beskriver formuleringen og brugen af en injicerbar polymer-nanopartikel (PNP) hydrogel platform, der udviser tunable mekaniske egenskaber, en høj grad af biokompatibilitet og lav immunogenicitet, og præsenterer steder for conjugating bioaktive molekylære signaler^{27,28,29,30,31,32,33}. Disse PNP hydrogels består af hydrofobisk modificerede cellulosepolymerer og selvmonterede nanopartikler bestående af poly(ethylenglycol)-blok-poly(mælkesyre) (PEG-PLA)^27,34, der interagerer for at producere et supramolelekylært netværk. Mere specifikt interagerer de dodecyl-modificerede hydroxypropylmethyl cellulosepolymerer (HPMC-C₁₂₎dynamisk med overfladen af PEG-PLA nanopartikler og bro mellem disse nanopartikler for at danne dette polymernetværk^27,34. Disse dynamiske, multivalente interaktioner gør det muligt for materialerne at forskyde sig under injektionen og hurtigt selvhelbrede efter administration. PNP hydrogelkomponenterne fremstilles let ved hjælp af enkle en-pot reaktioner og PNP hydrogel dannes under milde forhold ved simpel blanding af de to komponenter³⁵. På grund af den lette fabrikation kan denne hydrogelplatform i høj grad oversættes i stor skala. PNP hydrogels mekaniske egenskaber og maskestørrelse styres ved at ændre vægtprocenten af polymer- og nanopartikelkomponenterne i formuleringen. Tidligere undersøgelser med denne platform viser, at PNP hydrogels er meget biokompatible, biologisk nedbrydelige og ikke-immunogene^28,30,31. Samlet set disse hydrogels nuværende brede nytte i biomedicinske applikationer, der omfatter post-operative vedhæftning forebyggelse, vævsteknik og regenerering, vedvarende medicin levering og immunoengineering.

Protocol

Før du begynder på denne protokol, er det nødvendigt at syntetisere HPMC-C12 og PEG-PLA ved hjælp af tidligere udgivne metoder27,28,29,30,31,36,37,38. 1. Nanopartikelsyntese ved nanoforebyggelse BEMÆRK: Dette afsnit beskriver syntesen af et enkelt parti NPs, der producerer 250 μL af 20 wt% NPs i bufferopløsning (50 mg tør PEG-PLA polymer pr. batch). Bemærkninger til opskalering af antallet af batches findes på relevante trin. 50 mg PEG-PLA-polymer måles i et 8 ml glasscintillationsglas, og der tilsættes 1 ml acetonistril. Vortex til fuldt opløst.BEMÆRK: For at opskalere antallet af partier skaleres dette trin lineært og tilsættes den samlede mængde polymer og opløsningsmiddel, der er nødvendig i et enkelt hætteglas. Tilsæt 10 ml ultrapure vand i et 20 ml glasscintillationsglas med en lille rørestang. Sæt på en røreplade indstillet til 600 omdrejninger i minuttet.BEMÆRK: Hvis trin 1.1 er skaleret, er det stadig nødvendigt at have et individuelt scintillationsglas at bundfælde i for hvert tilsvarende parti. For eksempel, for 200 mg polymer opløst i 4 ml acetonitril, forberede 4 x 20 ml scintillation hætteglas. For at danne NPs ved nanoprecipitation tilsættes 1 ml polymeropløsning med opløsningsmiddel dropwise i vandet ved hjælp af en 200 μL pipette. Rør i 2 min. PLA-blokken af PEG-PLA er ikke opløselig i vand, og som følge heraf vil core-shell NPs selv samles med de hydrofobe PLA-blokke som kernen og de hydrofile PEG-blokke som skallen. Kontroller partikelstørrelsen ved hjælp af DLS (Dynamic Light Scattering).BEMÆRK: Denne procedure er specielt skrevet til en kommercielt tilgængelig pladelæser med den tilhørende softwarepakke (se Materialetabel). Ved anvendelse af alternative instrumenter henvises til de prøveforberedelsesmetoder, som instrumentets fabrikant har beskrevet. 20 μL NP-opløsning fortyndes med 80 μL ultrapurt vand (analysekoncentration: 1 mg/mL PEG-PLA NPs). Der tilsættes 30 μL pr. brønd til en klar bundsort 384-brøndsplade (analyser i tre eksemplarer). Mål den hydrodynamiske radius og polydispersiteten af hver prøve med en DLS-pladelæser ved hjælp af forudindstillede protokolindstillinger i softwarepakken. Som et eksempel på en typisk protokol skal du indstille dataindsamlingsparametrene til at erhverve 5-10 DLS-målinger af 2-5 s varighed pr. erhvervelse og derefter rapportere en gennemsnitlig partikelstørrelse og -fordeling pr. brønd beregnet ud fra den kugleformede proteinmodel. For at danne hydrogeler med konsistente reologiske egenskaber skal de resulterende partikler være 30-50 nm i hydrodynamisk diameter med en polydispersitet (PD) < 0,2.BEMÆRK: Hvis NPs er mindre end ønsket, skal du bruge en opløsning på 75% acetonil / 25% dimethylsulfoxid (DMSO) i trin 1.1. En forøgelse af procentdelen af DMSO i opløsningsmiddelopløsningen vil generelt øge partikelstørrelsen. NP-opløsningen overføres fra 20 ml scintillationsglasset til en centrifugalfilterenhed. Centrifuge ved 4500 x g i 1 time for at koncentrere NP-opløsningen til <250 μL. Resuspend i ønsket buffer, såsom fosfat-buffered saltvand (PBS), til 20 wt% NPs. Pipette indholdet af centrifugalfilterenheden i et tjæret mikrocentrifugerør eller glasscintillationsglas på en massebalance. Brug en lille mængde buffer (50-100 μL) til at skylle filteret og sikre indsamling af alle NPs. Tilføj buffer for at nå en samlet masse på 250 mg.BEMÆRK: Batches kan samles under genoplivning. NP-stamopløsninger kan opbevares ved 4 °C i ca. 1 måned. Må ikke fryses. Hvis du vil have længere lagerplads, skal du kontrollere DLS’ størrelse og polydispersitet før brug. 2. Hydrogel formulering og indkapsling af narkotika eller celler BEMÆRK: Dette afsnit beskriver forberedelse af 1 ml 2:10 PNP hydrogel formulering, med 2:10 betegner 2 wt% HPMC-C12 og 10 wt% NPs (12 wt% total fast polymer) og 88 wt% buffer løsning, lægemiddel last løsning, eller celle suspension. Formuleringsprocenterne kan varieres for at give hydrogeler med en række mekaniske egenskaber. For eksempel blev 1:5 PNP hydrogels brugt til celleafregning og levedygtighed eksperimentelle resultater vist. Forbered lagerløsning på 6 wt% HPMC-C12 i PBS (eller anden buffer valg). Opløs i 48 timer for at sikre, at polymeren er fuldt spredt.BEMÆRK: HPMC-C12-lageropløsningen er stabil i månedsvis ved stuetemperatur. Opbevaring ved 4 °C anbefales dog at hæmme mikrobiel vækst. Der tilsættes 333 mg 6 wt% HPMC-C12-opløsning i en 1 ml Luer-låsesprøjte. Der tilsættes 500 μL 20 wt% NP-stamopløsning til et mikrocentrifugerør. Der tilsættes 167 μL PBS og pipette, der skal blandes. Brug en nål til at fylde en anden 1 mL Luer-låsesprøjte med den fortyndede NP-opløsning.BEMÆRK: For at laste lægemiddellast skal du beregne den ønskede endelige koncentration af lægemidlet i hydrogelen og indlæse den passende mængde i 167 μL PBS, der blandes med NPs. Hvis en molekylær sonde er nødvendig for en in situ-analyse, f.eks. til overvågning af lægemiddelstabilitet, skal sonden indlæses på samme måde som beskrevet ovenfor til lastning af lægemiddellast. For at indlæse celler skal du beregne den ønskede slutcellekoncentration i hydrogelen og indlæse det relevante antal celler i 167 μL PBS, der blandes med NPs. Bland de to hydrogelkomponenter (HPMC-C12 og NPs) ved hjælp af en albueblandingsmetode35. Fastgør Luer-albuestikket til sprøjten, der indeholder NP-opløsning (eventuelt også indeholdende lægemiddellast eller celler). Skub NP-opløsningen gennem albuen, indtil menisken er synlig i den åbne ende. Træk lidt tilbage og tilslut sprøjten, der indeholder HPMC-C12-opløsning. BEMÆRK: Det er vigtigt at minimere luft i albuetilslutningen for at forhindre dannelse og spredning af bobler under hele hydrogelen under blandingsprocessen. Når du blander celler med albueblanderen, skal du sørge for at blande mere forsigtigt, da blanding for hurtigt kan udsætte cellerne for høje forskydningskræfter, hvilket fører til celledød. Pump de to opløsninger frem og tilbage gennem albueblanderen i ca. 60 cyklusser, indtil der er dannet et homogent, uigennemsigtigt hvidt hydrogelmateriale. Skub hele mængden af hydrogel i en sprøjte. Fjern den tomme sprøjte, og træk stemplet tilbage på den gelbelastede sprøjte for at genvinde materiale fra albuestikket. Cap med en nål eller stik.BEMÆRK: Det er nødvendigt at tage højde for ~300 μL tabt hydrogelvolumen på grund af det døde rum i blandingsprocessen. Hvis der f.eks. ønskes 700 μL endelig hydrogelvolumen, skal der fremstilles 1 mL hydrogel. Hydrogelformuleringsprocessen kan skaleres op ved hjælp af større sprøjter. Men for stive hydrogel formuleringer, såsom 2:10, kan det blive vanskeligt at blande og injicere fra sprøjter større end 3 mL i volumen på grund af det stigende forhold mellem sprøjte tønde til albue eller nål diameter. Opbevar hydrogelen i sprøjten ved stuetemperatur. Men hvis lægemidler indkapsles, anbefales opbevaring ved 4 °C, medmindre lægemiddelproducenten angiver andet. Materialet må ikke fryses. 3. Måling af hydrogelformuleringers reologiske egenskaber BEMÆRK: Denne protokol anvendes specifikt sammen med det kommercielle reometer, der er nævnt i materialetabellen med en 20 mm savtakket pladegeometri. For brug af andre instrumenter henvises til fabrikantens vejledning til prøveforberedelse. Der skal formuleres mindst 700 μL PNP hydrogel med henblik på reologisk karakterisering. Injicere materiale i midten af den takkede rheometerplade. Mængden vil variere afhængigt af det valgte geometrigab. Til reference kræver et mellemrum på 700 μm ~400-500 μL materiale. Sænk remetret til trimgabet (500-1000 μm), og drej langsomt den øverste reometerplade, når den kommer i kontakt med PNP-hydrogelen for at sikre, at hullet fyldes jævnt og fuldstændigt. Undersøg lastningen af PNP hydrogel, så den dækker hele reometerpladens overflade. Brug en spatel eller plasttrimmer til forsigtigt at trimme og fjerne overskydende materiale, så det har en meget lille bule ud af pladen. Sænk remetret til det endelige geometrigab, og kontroller, at prøven er rent lastet. Måle prøvens mekaniske egenskaber ved hjælp af oscillatoriske test, f.eks.BEMÆRK: I de viste repræsentative data udføres oscillatoriske amplitudetest med en konstant frekvens på 10 rad/s. Oscillatoriske frekvens sweeps køres med en konstant 1% stamme, inden for det lineære viskoelastiske regime af amplitude sweep. Flow sweeps blev kørt fra høje forskydningshastigheder til lave forskydningshastigheder39. Alle test afsluttes med 10 point pr. årti med indsamlede data og ved stuetemperatur. Det kan være nødvendigt at justere testparametrene afhængigt af formuleringens egenskaber. Hvis stivere PNP-materialer som f.eks. Repræsentative data vist nedenfor kan bruges til sammenligning under kvalitetskontroltest. 4. Karakteristik in vitro stof frigivelse Forbered kapillærrør ved at skære glaskapillærrør til den ønskede længde. Forsegl den ene ende af hvert rør ved at bruge en engangsspatel eller pipettespids til at skubbe en lille mængde epoxy ind i enden af røret for at danne et stik. Tillad, at epoxy indstilles pr. producents anbefalede tid.BEMÆRK: Røret skal være kortere end længden af injektionsnålen. Slanger med en indvendig diameter på 2-3 μm anbefales således, at en længde på 2,5 tommer vil indeholde mindst 300 μL af det samlede volumen. Der skal formuleres mindst 500 μL af et PNP hydrogelmateriale i en sprøjte, der indeholder det pågældende stof. Forbered hver prøvegruppe i en separat sprøjte. 100-200 μL af PNP-hydrogelen indsprøjtes i bunden af hvert kapillærrør ved hjælp af en lang hypodermisk nål (22 G, 4 tommer). Der fremstilles mindst tre rør (tre eksemplarer) pr. prøvegruppe. (Valgfrit) Der anbringes fyldte kapillærrør i et konisk centrifugerør og centrifuge i 1 min ved 1000 x g for at sikre, at hydrogelens overflade er ensartet. Dette trin skal muligvis gentages, hvilket ændrer tid og hastighed efter behov for at glatte overfladen af materialet.ADVARSEL: Sørg for, at centrifuge er velafbalanceret. Fyld forsigtigt 200-300 μL PBS oven på hydrogelen i kapillærrøret ved hjælp af en sprøjte og nål eller pipette. Hydrogelens overflade må ikke kontaktes eller forstyrres. Forsegl røret med en hætte eller et stik eller dæksel med mindst to lag paraffinfilm. (Valgfrit) Inkuber prøver ved 37 °C for at simulere in vivo-forhold. Fjern forsigtigt PBS helt fra hver kapillær uden at forstyrre hydrogeloverfladen ved hjælp af en sprøjte og nål på udvalgte tidspunkter afhængigt af den forventede tidsskala for frigivelse af lægemidler. Udskift den fjernede volumen med frisk PBS. Opbevar aliquots under passende forhold.BEMÆRK: De anbefalede mængder og tidspunkter i trin 4.3, 4.5 og 4.7 kan optimeres til at fange in vitro-lægemiddelfrigivelse over en række tidshorisonter, afhængigt af hvor meget stof der er indlæst i materialet, og hvor hurtigt det frigives til supernatanten. En prøve af udvalgte tidspunkter kunne være 6 timer, 1 dag, 3 dage, 1 uge og 2 uger for en langsom frigivelse stof. Aliquots kan også analyseres, da de erhverves snarere end opbevares. Ved afslutningen af undersøgelsen analyseres aliquots med en passende metode som ELISA, HPLC eller fluorescensanalyse for at kvantificere mængden af lægemiddel, der frigives på hverttidspunkt,punkt40,41,42. Den relevante påvisningsmetode vil variere afhængigt af det stof, der er af interesse.BEMÆRK: Undersøgelser med in vitro-udslip er nyttige til sammenligning af udslip mellem forskellige hydrogelformuleringer eller lægemiddellast. Tidshorisonten for in vitro-frigivelse angiver ikke ofte en forventet tidsskala for frigivelse in vivo. 5. Karakteriserer termisk stabilitet af gel-indkapslet insulin Der skal formuleres mindst 1,2 mL PNP hydrogel pr. prøvegruppe. Efter den procedure, der er beskrevet i punkt 2.3, indlæses både insulin (lægemiddellast) og thioflavin T (ThT) (molekylær sonde) i PNP-hydrogelen.BEMÆRK: Den primære sammenlægningsmekanisme og derfor inaktivering af insulin er gennem dannelsen af amyloidfibriller. ThT er en egnet molekylær sonde, fordi den producerer et stærkt fluorescenssignal i nærværelse af amyloidfibriller, hvilket giver mulighed for in situ-overvågning af insulinsammenlægning. Afhængigt af narkotika last af interesse, sammenlægning kan overvåges ved hjælp af forskellige metoder. For de viste repræsentative data blev insulin lastet til en endelig koncentration på 6,7 eller 10 mg/mL og ThT til en endelig koncentration på 25 μM. Ved hjælp af en 21 G nål injiceres 200 μL PNP hydrogel pr. godt ind i en sort 96-brønds plade. Hver prøvegruppe måles i mindst tre eksemplarer. Tætningsplade med en optisk klar klæbepladeforsegling for at forhindre fordampning. Indsæt plade i en pladelæser udstyret med temperaturkontrol, rysten og kinetisk læseprogrammering og begynd at læse protokollen. Der blev indhentet repræsentative data hos en kommercielt tilgængelig pladelæser (se materialeoversigten) under følgende betingelser: Stressede aldringsforhold: kontinuerlig lineær omrystning (410 cpm, 5 mm) ved 37 °C. Dataindsamling: excitation/emission 450 nm/482 nm med 20 minutters mellemrumBEMÆRK: Hvis en pladelæser med temperaturregulering, shaker og kinetiske læseegenskaber ikke er tilgængelig, kan pladen placeres på en shakerplade i en inkubator og aflæses manuelt ved over bølgelængder på udvalgte tidspunkter. Plot data som gennemsnitlig fluorescens signal over tid for hver gruppe. Tid til aggregering kan kvantificeres ved at definere en vilkårlig signaltærskel43.BEMÆRK: For de repræsentative data, der er vist nedenfor, blev tærsklen defineret som 750 000 vilkårlige fluorescensenheder (AFU). Denne værdi blev valgt til at være over den målte basislinje, mens den stadig i tilstrækkelig grad opfangede aggregeringsdelens indfaldsstof, hvilket indikeredes ved en kraftig stigning i lysstofrøret. Afslut analysen, når prøverne samles eller visuelt begynder at dehydrere. 6. Vurdering af celle levedygtighed Der skal formuleres mindst 2 mL PNP hydrogel, der indeholder den ønskede cellekoncentration i nedenstående protokoller (normalt 1 – 5 x 106 celler/mL). Forbered hver prøvegruppe i en separat sprøjte. Ved hjælp af en 21G-nål injiceres 150 μL PNP hydrogel i hver brønd i en klar bund 96-brønds plade; hver brønd er en replikat. Hver prøvegruppe skal have 3-5 replikater pr. tidspunkt. Centrifuge pladen ved 50 x g i 2 minutter for at sprede hydrogel jævnt i brønden. Der tilsættes 100 μL af det relevante cellemedie oven på hydrogelen. Fjern dette medie hver dag og tilføj 100 μL nye medier. På dag 1 skal du fjerne mediet oven på hydrogelen for de udpegede replikater for det pågældende tidspunkt for hver prøvegruppe. Der tilsættes 50 μL 2 mM calcein AM-opløsning oven på hydrogelerne. Inkuber i 30 min.BEMÆRK: Calcein AM kan bruges til at identificere og mærke levende celler. I levende celler omdannes den ikke-fluorescerende calcein AM til en grøn-fluorescerende calcein ved intracellulære esteraser efter acetoxymethylester hydrolyse. Billede midten af hver brønd i en 96-brønds plade ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Et areal på mindst 300 μm2 med en z-stak, der strækker sig over mindst 150 μm, undersøges. Brug konfokale bølgelængdeindstillinger til at registrere calceins fluorescens (excitation/emission: 495 nm/515 nm). Gentag trin 6.4 og 6.5 for hvert efterfølgende tidspunkt efter behov. Hvis du vil analysere hvert billede, skal du skjule alle z-stack-billeder i et enkelt plan med maksimal intensitet ved hjælp af FIJI eller lignende software. Kvantificere antallet af fluorescerende celler i hvert billede. Forholdet mellem antallet af fluorescerende celler på hvert tidspunkt sammenlignet med antallet af fluorescerende celler på dag 1 er den relative celle levedygtighed i PNP hydrogels. 7. Vurdering af cellemark Det antal celler, der kræves for at formulere 500-700 μL PNP hydrogel ved en endelig koncentration på 5 x 106 celler/mL, beregnes. Celler suspenderes i 1 mL PBS ved en koncentration på 1 x 106 celler/mL. Pletceller ved at tilsætte 50 μL 2 mM calcein AM. Inkuber cellerne med farvestoffet i 10 min. Centrifugeceller ved passende forhold, fjern PBS og opsætte cellerne i det volumen af PBS, der er nødvendigt for at danne 500-700 μL af den ønskede PNP hydrogel.BEMÆRK: Den anbefalede hastighed og varighed til centrifuge for hver enkelt celletype findes typisk i produktdokumentationen. 500-700 μL PNP hydrogel med de farvede celler (5 x 106 celler/mL) efter protokolafsnit 2. Ved hjælp af en 21G-nål injiceres 100-200 μL PNP hydrogel, der indeholder de farvede celler i bunden af en cuvette. Der skal udføres tre replikater for hver prøve. Flyt nålen frem og tilbage i kuvetten, mens du injicerer for at forhindre bobledannelse. Umiddelbart (tid t = 0), billede cuvettes liggende på deres side over hele den flade cuvette rektangel område i bunden af cuvette. Brug confocal flise scanning kapaciteter til at afbilde hele brønden området og billede en z-stack i 3D på tværs af en 100 μm dybde. Til senere visualisering skal du enten bruge confocal mikroskopsoftwaren til at sy alle de enkelte fliser sammen og udføre en maksimal intensitetsprojektion for at danne et enkelt billede af det store område eller bruge FIJI-software på en personlig computer44,45. Efter billeddannelse, stå cuvettes oprejst. Billede ved 1 time og 4 timer for at observere, om cellerne har slået sig ned i hydrogel, eller om de forbliver suspenderet.BEMÆRK: Disse tidspoint er forslag og kan ændres efter behov. Hvis du vil analysere hvert billede, skal du skjule alle z-stack-billeder i et enkelt plan med maksimal intensitet. Brug FIJI eller lignende software til at kvantificere cellefordelingen ved at måle fluorescensintensiteten ned ad cuvetteens midterste lodrette profil for at bestemme graden af afregning.

Representative Results

PNP hydrogel fabrikation og karakteriseringPNP hydrogels dannes ved blanding af de to primære komponenter – hydrofobisk modificerede HPMC polymerer og PEG-PLA nanopartikler (Figur 1a). Terapeutisk last er lettest indarbejdet i den ekstra buffer, der anvendes til at fortynde nanopartikelkomponenten inden hydrogelpræparatet. Til downstream biomedicinsk karakterisering er det praktisk at bruge en albueblandingsmetode, der muliggør enkel og reproducerbar blanding af de to komponenter (Figur 1b). Efter tilstrækkelig blanding skal hydrogelen føles fast i sprøjten, men udbyttet under tryk og ekstrudere fra en standardnål (21G vist) (Figur 1c). Efter injektionen skal hydrogelen hurtigt sættes i et fast lignende materiale, der modstår flow fra tyngdekraften. For fuldt ud at karakterisere hydrogel og sikre konsekvent batch-til-batch produkter, bør prøverne analyseres ved hjælp af flere forskellige eksperimenter på et remetometer. Gelens forskydningsfortyndings- og selvhelbredende egenskaber vil let kunne observeres ved hjælp af henholdsvis en flowforskydningsprotokol og step-shear-protokol (Figur 2a, b). For stivere geler, såsom 2:10 formulering, bør brugeren kigge efter viskositet til at falde mindst to størrelsesordener under flow feje som forskydningen sats øges fra 0,1 til 100 s-1, som simulerer de mekaniske forhold under injektionen. Step-shear-protokollen skal afsløre et fald i viskositeten under trinnet med høj forskydning og en hurtig tilbagevenden (<5 s restitutionstid) til baseline viskositeten under trinnet med lav forskydning. Karakterisering af lagrings- og tabsmoduli ved hjælp af et oscillatorisk forskydningsfrekvensforskydningseksperiment i det lineære viskoelastiske regime skal afsløre solide egenskaber ved frekvensområder fra 0,1-100 rad s-1 (Figur 2c). Især bør der typisk ikke være en crossover af forskydningen opbevaring og tab moduli, der kan observeres ved lave frekvenser for stivere formuleringer som 2:10 hydrogels. En sådan crossover-hændelse kan indikere problemer med kvaliteten af råvarerne, enten den modificerede HPMC- eller PEG-PLA-polymer, eller størrelsen og spredningen af PEG-PLA-nanopartiklerne. Det skal bemærkes, at en crossover begivenhed kan forventes for svagere hydrogel formuleringer, såsom 1:5 hydrogel. Oscillatorisk shear amplitude fejer på PNP hydrogels afslører, at materialerne ikke giver, før høje stressværdier er anvendt, hvilket indikerer, at disse materialer har en udbyttebelastning, en tærskelmængde af stress, der kræves for, at materialet kan strømme. Karakteriserer frigivelse kinetik fra PNP hydrogelsEt vigtigt skridt i udformningen af PNP geler til levering af lægemidler er karakteriseringen af stof frigivelse kinetik fra en valgt formulering. Der findes flere teknikker til dette, men en simpel in vitro-metode giver nyttige data under tidlig formuleringsudvikling (figur 3a). At variere polymerindholdet i PNP-hydrogelerne ved at modulere mængden af HPMC-C12 eller NP’er er den mest enkle måde at indstille disse hydrogelers mekaniske egenskaber og maskestørrelse på, hvilket kan have en direkte indvirkning på diffusionen af last gennem polymernetværket og frigivelseshastigheden fra materialerne (Figur 3b). For last, der er større end den dynamiske maskestørrelse (dvs. høj molekylvægt eller stor hydrodynamisk radius), bør forskerne forvente en langsom, opløsningsmedieret frigivelse af last fra hydrogeldepotet. Formuleringer med dynamiske maskestørrelser, der er større end eller lig med lastensstørrelse,giver mulighed for diffusionsmedieret frigivelse, der kan beskrives ved hjælp af traditionelle modeller for lastspredning og frigivelse46,47,48,49. Baseret på formen af frigivelseskurven kan forskere omformulere hydrogelen for at tune den mod langsommere (f.eks. øge polymerindholdet) eller hurtigere (f.eks. reducere polymerindholdet) frigivelse. Vurdering af stabiliteten af terapeutisk lastBestemmelse af stabiliteten af den terapeutiske last i en hydrogel formulering er kritisk, før du begynder prækliniske eller cellulære undersøgelser. Sammenlignet med andre syntetiske metoder til indkapsling af lægemidler inkorporerer PNP hydrogels last på en blid måde ved at blande sig i bulkmaterialet, og det er usandsynligt, at indkapsling vil beskadige lasten. Disse undersøgelser viser, at PNP hydrogels også kan stabilisere last, der er modtagelige for termisk ustabilitet, såsom insulin, betydeligt forlænge holdbarheden og reducere afhængigheden af køleopbevaring og distribution (Figur 4). Det er vigtigt at vurdere lastens tilstand umiddelbart efter indkapslingen i hydrogelen samt efter længere opbevaringsperioder. Disse data viser, at insulin forbliver stabilt i hydrogels efter 28 dages opbevaring under kontinuerlig termisk og mekanisk stress ved hjælp af en simpel fluorescensanalyse til måling af insulinsammenlægning. En alternativ teknik i tilfælde, hvor en passende pladeanalyse ikke er tilgængelig, ville være at udføre cirkulære dikhroismemålinger af lasten, hvilket er særlig nyttigt til bestemmelse af proteinmedicinens sekundære struktur. Bestemmelse af celle levedygtighed og spredning i PNP hydrogelsMange terapeutiske celler kræver vedhæftning motiver til at forblive levedygtige, og dermed inddragelse af integrin motiver som arginin-glycin-aspartic syre (RGD) peptider er et vigtigt skridt i tilpasningen PNP hydrogels for cellulære behandlinger50. Den modulære PEG-PLA polymer bestående af NPs muliggør kemisk funktionalisering af PEG corona gennem enkle “klik” kemier28,51. I dette eksempel blev celleklæbende RGD-peptider fastgjort til PEG-PLA-polymeren for at fremme celleengagement med PNP-hydrogelstrukturen. Formuleringer, der mangler vedhæftningssteder, vil have lav cellegabilitet, da indkapslede celler ikke formerer sig i forhold til celler indkapslet i formuleringer med disse vedhæftningsmotiver (Figur 5a, b). Indkapslede celler kan mærkes med calcein AM eller et andet passende fluorescerende farvestof (f.eks. CFSE) for at lette celletælling med et fluorescensmikroskop. Under optimeringen bør levedygtigheden sammenlignes med uændrede PNP-hydrogeler for at sikre, at integrinfunktionaliserede formuleringer giver øget levedygtighed og spredning. Hvis integrinfunktionaliserede formuleringer giver samme effekt som umodificerede hydrogeler, kan dette indikere en fejl i den bøjningskemi, der bruges til at inkorporere vedhæftningsmotiverne. Forskere bør forvente indkapslede celler, der skal jævnt spredt gennem hydrogel medium, når du bruger en passende hydrogel formulering. Dette vil give mulighed for konsekvent og forudsigelig dosering af celler under hydrogel administration og bør oversætte til lokal tilbageholdelse af celler i hydrogel efter administration. Fordelingen af celler kan let bestemmes ved hjælp af fluorescensmikroskopiteknikker. Celler kan mærkes med et passende farvestof og derefter afbildes ved hjælp af konfokal mikroskopi. Billederne kan vurderes visuelt (Figur 5c) og også kvantitativt (Figur 5d) ved hjælp af ImageJ-software til at måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet langs billedets lodrette akse (eller langs den aksecelleafregning på grund af tyngdekraften, der forventes at forekomme). Hvis hydrogelformuleringen er for svag til at understøtte cellerne i suspension over længere tidsrammer, vil celleaflejring forekomme, som observeret i 1:1-formuleringen i figur 5. Forøgelse af polymerindholdet kan løse problemer med uoprigtig cellespredning på grund af afregning. Figur 1: Polymer-nanopartikel (PNP) hydrogels dannes let ved at blande to komponenter. Blid blanding af disse to komponenter giver en injicerbar hydrogel, hvor HPMC-C12 polymerer fysisk krydses af dynamiske, multivalente interaktioner med PEG-PLA nanopartiklerne. (b) Fotografi, der viser gelformulering ved blanding med to sprøjter, der hver indeholder en komponent i PNP-hydrogelen. Ved at forbinde de to sprøjter med et Luer-lock albuestik kan de to komponenter let blandes under sterile forhold for at give en boblefri hydrogel forudindlæst i en sprøjte til øjeblikkelig brug. NP-opløsningen er farvet blå med henblik på demonstration. c) Paavisning af til fostning af PNP-hydrogeler og genstørkning heraf . i) PNP hydrogel i en sprøjte med en fastgjort 21G-nål. (ii) Injektion placerer hydrogel under forskydning, som midlertidigt bryder samspillet mellem polymer og nanopartikler, hvilket skaber en væskelignende konsistens. (iii) Efter injektionen reformerer de dynamiske polymer-nanopartikelinteraktioner hurtigt, så hydrogelen kan helbrede sig selv til et fast stof. (iv) Den faste hydrogel flyder ikke under kræfter, der er svagere end udbyttebelastningen, såsom tyngdekraften. PNP hydrogel er farvet blå med henblik på demonstration. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2:Rheologisk karakterisering af to PNP hydrogelformuleringer. Formuleringer er betegnet som polymer wt.%: NP wt.%. (a) Stabil forskydning flow fejer fra lav til høj forskydningshastighed af PNP hydrogels. Viskositet som funktion af forskydningshastigheden karakteriserer forskydningsfortyndende egenskaber. b) Viskositet som funktion af oscillerende forskydningshastigheder mellem lave forskydningshastigheder (hvid baggrund; 0,1 s−1) til høje forskydningshastigheder (rød baggrund; 10 s−1), der viser selvhelbredende egenskaber ved PNP-hydrogeler. Shear satser er pålagt for 30 s hver. (c) Elastisk opbevaring modulus G’ og tyktflydende tab modulus G” som en funktion af frekvensen ved en konstant 1% stamme for forskellige PNP hydrogel formuleringer. (d) Amplitude fejer med en konstant frekvens på 10 rad / s til at karakterisere elastisk opbevaring modulus G’ og tyktflydende tab modulus G” af PNP hydrogels som en funktion af stress. Denne reologiske karakterisering kan bruges som sammenligning for kvalitetskontrol. Dette tal er blevet tilpasset fra Grosskopf et al.28Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: In vitro-udgivelse af bovin serumalbumin (BSA) fra PNP hydrogels. Formuleringer er betegnet som polymer wt.%: NP wt.%. a) Skematisk beskrivelse af den eksperimentelle in vitro-frigivelsesprotokol. Aliquots fjernes fra PNP hydrogel-belastede kapillærrør over tid. b)In vitro-udslip af BSA fra 1:10 PNP, 2:5 PNP og 2:10 PNP indberettet som masse indsamlet ved det angivne tidspunkt divideret med den samlede masse, der blev indsamlet under analysen (data vist som middel ± SD; n = 3). BSA blev opdaget gennem absorbansmålinger. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: Termisk stabilitet af insulin indkapslet i PNP hydrogels ved ThT-analyse. Formuleringer er betegnet som polymer wt.%: NP wt.%. Insulin indkapslet i både 1:5 og 2:10 PNP hydrogel forblev uopdaget i over 28 dage ved stressede aldringsforhold på 37 °C og konstant agitation. Tid til sammenlægning af insulin formuleret i PBS var 20 ± 4 timer (gennemsnitlig ± SD, aggregering tærskel 750.000 AFU). Data præsenteret som et gennemsnit på n = 4 eksperimentelle replikater (AFU, vilkårlige fluorescensenheder). Dette tal er blevet tilpasset fra Meis et al.38Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5: Celle levedygtighed og celleafregning i PNP hydrogels. (a) Repræsentative billeder af levedygtige HMSC’er i 1:5 PNP hydrogels med og uden cell-klæbende arginin-glycin-aspartic syre (RGD) motiv konjugeret til PEG-PLA NPs. hMSCs blev calcein-farvede i 30 minutter før konfokal billeddannelse. Skalalinjen repræsenterer 100 μm. (b) Celles levedygtighed på dag 6 defineret som antallet af fluorescerende celler i billedet i forhold til antallet af fluorescerende celler på dag 1 (data vist som middelværdi ± SD; n = 3). (c,d) Celleindkapsling og afregning af eksperimenter med hMFC’er. (c) Maksimal intensitet billeder af calcein AM-farvede HMSCs indkapslet i 1:1 PNP hydrogel (øverste række) og 1:5 PNP hydrogel (nederste række) på tværs af 4 timer til at kvantificere celle afvikling. Skalalinjen repræsenterer 1 mm. (d) Gennemsnitlig vandret pixelintensitet for HMSC’er langs hydrogelens lodrette profil. Dette tal er blevet tilpasset fra Grosskopf et al.28Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Polymer-Nanopcle (PNP) hydrogels er let fremstillet og muliggøre langsigtet lokal levering af terapeutiske celler og lægemidler gennem minimalt invasiv administration via direkte injektion eller kateter levering. Disse protokoller beskriver formuleringen af PNP hydrogels og karakteriseringsmetoderne til at sikre kvaliteten af de resulterende materialer. Supramolekylære PNP hydrogels er skalerbare til fremstilling og dannes gennem simpel blanding af modificerede cellulose polymerer og polymere kerneskal nanopartikler. De nuværende metoder beskriver lette procedurer til at danne geler forudindlæst i sprøjter gennem enkle albueblandingsprotokoller. Gennem kvalitetskontrol målinger af hver af de komponenter, såsom DLS til at overvåge NP størrelse og distribution, kan man reproducerbart formulere PNP hydrogel materialer med konsekvente rheologiske egenskaber. Ved at variere mængden af HPMC-C₁₂ eller NPs kan man modulere maskestørrelsen og stivheden af den resulterende PNP hydrogel. Disse egenskaber kan indstilles, så de passer bedst til en bestemt biomedicinsk anvendelse, og med de rheologiske metoder, der er beskrevet her, kan forskere karakterisere PNP hydrogels forskydning og selvhelbredende egenskaber, når de optimerer platformen til deres specifikke applikationer. Metoder til in vitro-udgivelsesundersøgelser beskrives også; Forskere kan bruge disse undersøgelser til at karakterisere den relative tidshorisont for frigivelse af stoffer af interesse, der informerer fremtidige in vivo-undersøgelser. Ved hjælp af stabilitetsundersøgelser kan forskere også vurdere disse materialers evne til at hjælpe med at bevare den biologiske struktur og stabilitet af følsomme bioterapeutik over tid og ekstreme temperaturer med tvingende potentielle anvendelser for at reducere bioterapeutikkens afhængighed af kølekæder. Endelig kan cellevækst og migration inden for PNP-materialer evalueres med enkle cellerabilitetsanalyser med potentielle anvendelser i celleterapier og stilladser.

Vores gruppe har fundet mange overbevisende applikationer til PNP hydrogel platform²⁷. PNP hydrogels er blevet brugt til langsom levering af underenhedsvacciner, hvilket muliggør matchede kinetiske frigivelsesprofiler af antigener og adjuvanser for at øge omfanget, varigheden og kvaliteten af det humoristiske immunrespons³¹. PNP hydrogels har vist sig at have en mindre maskestørrelse end de fleste almindeligt anvendte hydrogels, så de er effektive til at bremse diffusion og langsomt frigive molekylær last. PNP hydrogels unikke vævsophæftningsegenskaber og mekaniske egenskaber er også blevet udnyttet til at danne fysiske barrierer for at forhindre vedhæftninger som følge af kirurgi ved at sprøjte hydrogelerne over store overfladearealer af organer efter operation³⁰. PNP hydrogels har også vist sig at være effektive celleleveringskøretøjer, og de mekaniske egenskaber beskytter faktisk celler mod de mekaniske kræfter, der forekommer i sprøjtenålen under injektionen, hvilket forbedrer celleleveevnen²⁹. Når NPs er konjugeret med en celle-klæbende peptid, celler kan vedhæfte og engagere sig med PNP matrix til at forblive levedygtige. Ved hjælp af denne fremgangsmåde har PNP hydrogels vist sig at forbedre den lokale tilbageholdelse af injicerede stamceller sammenlignet med metoder, der anvender flydende køretøjer²⁸. Derudover har PNP hydrogels vist sig at forhindre termisk induceret sammenlægning af indkapslet insulin, selv under barske stressede aldringsforhold, hvilket tyder på, at disse materialer kan være i stand til at reducere behovet for at køle temperaturfølsomme lægemidler³⁸.

Samlet set vil de metoder, der er beskrevet her, gøre det muligt for forskergrupper at fremstille og udforske PNP hydrogels som et biomateriale. Disse protokoller giver lab-skala syntese teknikker til at fremstille nok hydrogel materiale til at forfølge både in vitro og in vivo undersøgelser. De ovenfor beskrevne undersøgelser viser, at disse materialers dynamiske krydsforbindelser gør det muligt at være egnet til en række biomedicinske anvendelser ved at tillade aktiv motilitet af indspændte celler, samtidig med at passiv diffusion af molekylær last begrænses. Det forventes, at forskere vil finde PNP-platformen et tilgængeligt og kraftfuldt værktøj til at forbedre kliniske resultater gennem kontrolleret lægemiddellevering og til at studere grundlæggende biologiske mekanismer såsom cellerekruttering og mekanobiologi.

Materials

21G needles	BD	305165	PNP hydrogel injection
22G, 4 in hypodermic needles	Air-Tite	N224	In vitro release studies
384-well plates, black, clear bottom	Corning	3540	Dynamic light scattering (DLS)
96-well plates, black	Fisher Scientific	07-200-627	Biostability studies
96-well plates, clear	Corning	3599	Cell viability and settling studies
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C3100MP	Cell viability and settling studies
Capillary tubes	McMaster-Carr	8729K66	In vitro release studies
Centrifugal filter units	Fisher Scientific	UFC901024	NP concentration
Cuvettes	Millipore Sigma	BR759015-100EA	Cell viability and settling studies
DLS Plate Reader	Wyatt Technology	DynaPro II Plate Reader	Dynamic light scattering (DLS)
Epoxy	VWR International	300007-392 (EA)	In vitro release studies
Hypodermic needles	Air-Tite	8300015027	In vitro release studies
Luer elbow connector	Cole-Parmer	EW-30800-12	PNP hydrogel formulation
Luer lock syringe	Fisher Scientific	14-955-456	PNP hydrogel formulation
Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher Scientific	10010049	PNP hydrogel formulation
Plastic Spatula	Thomas Scientific	1229F13	Rheological characterization
Plate Reader	BioTek	Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader	Biostability studies
Plate seals	Excel Scientific	TS-RT2-100	Biostability studies
Recombinant human insulin	Gibco	A11382II	Biostability studies
Rheometer	TA Instruments	DHR-2 Rheometer	Rheological characterization
Thioflavin T	Sigma-Aldrich	T3516-5G	Biostability studies