Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

Summary

Questo protocollo descrive la generazione di iPSC libere da integrazione da fibroblasti del tessuto fetale attraverso la somministrazione di plasmidi episomiali mediante nucleofezione seguita dalla descrizione dei metodi utilizzati per la caratterizzazione iPSC e la differenziazione neuronale.

Abstract

Le aneuploidie cromosomiche causano gravi malformazioni congenite tra cui malformazioni del sistema nervoso centrale e morte fetale. Lo screening genetico prenatale è puramente diagnostico e non chiarisce il meccanismo della malattia. Sebbene le cellule dei feti aneuploidi siano preziose materie biologiche che portano l’aneuploidia cromosomica, queste cellule sono di breve durata, limitandone l’uso per esperimenti di ricerca a valle. La generazione di modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Si auto-rinnovano e si differenziano in cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale. Pertanto, le iPSC servono come strumenti eccellenti per studiare i primi eventi di sviluppo. La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi endocrini, metabolici, autoimmuni e cardiovascolari e difetti neurocognitivi. Il seguente protocollo descrive l’isolamento e la coltura di fibroblasti dal tessuto fetale TS (45XO), la generazione di TSiPSC libere da integrazione attraverso la somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale mediante nucleofezione seguita da caratterizzazione. Le TSiPSC di riprogrammazione sono state inizialmente sottoposte a screening mediante colorazione di fosfatasi alcalina a cellule vive, seguita da un’ampia indagine per i biomarcatori di pluripotenza. Colonie selezionate sono state sezionate meccanicamente, sono state attraversate più volte e cellule stabili auto-rinnovanti sono state utilizzate per ulteriori esperimenti. Le cellule hanno espresso fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, marcatori di superficie cellulare SSEA 4 e TRA1-81 tipici delle cellule staminali pluripotenti. Il cariotipo 45XO originale è stato mantenuto dopo la riprogrammazione. Le TSiPSC sono state in grado di formare corpi embrioidi e differenziarsi in cellule di endoderma, mesoderma ed ectoderma esprimendo biomarcatori specifici del lignaggio ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). I plasmidi episomiali esogeni sono stati persi spontaneamente e non rilevati dopo il passaggio 15 nelle cellule. Queste TSiPSC sono una preziosa risorsa cellulare per modellare il neurosviluppo molecolare e cellulare difettoso che causa deficit neurocognitivi associati alla sindrome di Turner.

Introduction

Le aneuploidie portano a difetti alla nascita / malformazioni congenite e perdita di gravidanza negli esseri umani. ~ 50% -70% dei campioni da perdite di gravidanza mostrano anomalie citogenetiche. Gli embrioni aneuploidi persi all’inizio della gravidanza non possono essere facilmente ottenuti per l’analisi sperimentale, sollevando la necessità di sviluppare altri modelli che rappresentino da vicino l’embriogenesi umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule con diagnosi di disturbi genetici sono state utilizzate per modellare le irregolarità genetiche rappresentative e le loro conseguenze sullo sviluppo fetale^1,2,3,4. Queste iPSC assomigliano alle cellule epiblastiche dell’embrione in via di sviluppo e possono ricapitolare i primi eventi di formazione dell’embrione. Consentono la comprensione e la caratterizzazione del programma di sviluppo dei lignaggi cellulari e il patterning nei primi embrioni di mammiferi. iPSC derivate in precedenza da fibroblasti cutanei e amniociti da test diagnostici prenatali di sindromi aneuploidiche come la monosomia X (sindrome di Turner), la trisomia 8 (sindrome di Warkany 2), la trisomia 13 (sindrome di Patau) e la trisomia parziale 11; 22 (sindrome di Emanuel) hanno fornito preziose informazioni sullo sviluppo fallito⁴.

La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara caratterizzata da infertilità femminile, bassa statura, disturbi endocrini e metabolici, aumento del rischio di malattie autoimmuni e predisposizione alle malattie cardiovascolari⁵. Sebbene sia l’unica sindrome da monosomia sopravvissuta, è anche letale per l’embrione in via di sviluppo causando aborti spontanei⁶. Gli individui sopravvissuti con TS presentano gradi di alterazione del materiale cromosomico X nelle loro cellule. I cariotipi vanno dalla perdita completa di un cromosoma X (45,XO) a mosaici come 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presenza di cromosomi ad anello, la presenza di materiale cromosomico Y, ecc^5.

La diagnosi della sindrome viene generalmente effettuata mediante cariotipizzazione del sangue di individui sintomatici e campionamento dei villi coriali (CVS) per rilevare le sindromi da aneuploidia precoce. Poiché le sindromi aneuploidiche rappresentano circa il 30% degli aborti spontanei, è di routine cariotipizzare il prodotto del concepimento (POC) su un aborto spontaneo. Queste cellule fetali tra cui i villi coriali che possiedono l’anomalia citogenetica e le iPSC da esse derivate forniscono una preziosa fonte di materiale biologico per studiare le sindromi da aneuploidia^4,6. Le iPSC TS sono state precedentemente stabilite da amniociti tramite riprogrammazione retrovirale⁴, fibroblasti di villi coriali (ottenuti attraverso diagnosi prenatale) tramite riprogrammazione retrovirale⁶, da cellule mononucleate del sangue⁷ tramite riprogrammazione del virus Sendai e da fibroblasti cutanei di individui TS tramite riprogrammazione lentivirale⁴ . Poiché l’obiettivo principale del nostro laboratorio è comprendere il fallimento dello sviluppo, abbiamo generato iPSC TS da POC, in particolare la componente villi corionica di un aborto spontaneo⁸. Tutte le cellule isolate da questo tessuto fetale avevano un cariotipo 45XO e producevano iPSC con lo stesso cariotipo. Queste iPSC sono uniche in quanto sono le prime ad essere generate da un feto abortito e forniscono una risorsa preziosa per studiare i fallimenti della gravidanza legati all’aneuploidia. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata della generazione di iPSC da questa fonte cellulare unica tramite riprogrammazione episomiale.

I primi metodi di generazione di iPSC utilizzavano la trasduzione virale e i trasposoni per fornire i fattori di riprogrammazione. I metodi per indurre le cellule alla pluripotenza si sono evoluti dall’uso di vettori retrovirali^{integranti 9,}vettori lentivirali escissibili^10,11 e metodi basati su trasposoni¹² a vettori adenovirali non integranti¹³ e vettori basati sul virus Sendai¹⁴. La riprogrammazione retrovirale e lentivirale, sebbene efficiente, comporta l’integrazione dei fattori di riprogrammazione nei cromosomi dell’ospite, causando mutazioni di inserzione che hanno effetti imprevisti nelle iPSC. Inoltre, la riprogrammazione virale impedisce l’applicazione traslazionale delle iPSC. Sono stati esplorati i sistemi basati sull’RNA¹⁵ e il rilascio diretto di proteine¹⁶ per eliminare completamente i potenziali rischi associati all’uso di virus e trasfezioni di DNA. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati inefficienti.

Nel 2011, Okita et al. hanno riportato una migliore efficienza di riprogrammazione da parte dei plasmidi episomiali aumentata con la soppressione di TP53 tramite shRNA. Hanno anche sostituito cMYC con LMYC non trasformante (MYC associato al carcinoma polmonare a piccole cellule) per migliorare la sicurezza delle hiPSC. Questi plasmidi episomiali esprimono 5 fattori di riprogrammazione: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA per TP53^17,18. Questi vettori vengono mantenuti extra-cromosomicamente e persi dalle cellule riprogrammate su coltura continua, rendendo così le linee prive di transgeni entro 10-15 passaggi. La nucleofezione è una forma specializzata di elettroporazione che fornisce acidi nucleici direttamente nel nucleo delle cellule ospiti. È un metodo efficiente per la consegna dei plasmidi di riprogrammazione in vari tipi di cellule. I plasmidi episomiali sono convenienti e compensano gli alti costi della nucleofezione. Questo metodo è efficiente e riproducibile in condizioni ottimizzate producendo iPSC stabili da una varietà di cellule somatiche. In questo protocollo, descriviamo il metodo per la generazione di iPSC da fibroblasti isolati dal tessuto fetale mediante nucleofezione di plasmidi di riprogrammazione episomiale. Ecco i protocolli dettagliati per l’isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali, la purificazione dei plasmidi, la nucleofezione, il prelievo di colonie dalla piastra di riprogrammazione e la creazione di iPSC stabili.

È essenziale confermare la presenza di tratti di pluripotenza nelle iPSC appena generate. Ciò include la dimostrazione di fattori correlati alla pluripotenza (ad esempio, espressione di fosfatasi alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-caderina; di solito mostrata con saggi di immunofluorescenza o espressione genica), identificazione dei tre strati germinali mediante saggi di differenziazione in vitro per convalidare i loro potenziali di differenziazione, cariotipizzazione per determinare il contenuto cromosomico, tipizzazione STR per stabilire l’identità con le cellule genitrici, verificare la perdita di geni esogeni, e saggi in vivo più rigorosi come la formazione di teratomi e la complementazione tetraploide. Qui descriviamo i protocolli di caratterizzazione del cariotipo, la colorazione della fosfatasi alcalina delle cellule vive, il rilevamento di biomarcatori correlati alla pluripotenza mediante immunofluorescenza, saggi di differenziazione in vitro e metodo per dimostrare la perdita di geni esogeni¹⁹.

Protocol

FCV sono stati ottenuti dal Manipal Hospital, Bengaluru, sotto l’approvazione del Comitato Etico degli Ospedali Manipal. NOTA: vedere la Tabella 1 per la composizione di tutti i buffer e le soluzioni. 1. Isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali (FCV) Raccolta del campione e disintegrazione dei tessuti nella collagenasi Raccogliere FCV in condizioni sterili in soluzione salina tampon…

Representative Results

Generazione di iPSC senza integrazione da un feto abortito spontaneamente con cariotipo 45XOAbbiamo isolato fibroblasti da FCV con un cariotipo 45XO specifico per la sindrome di Turner (TS) e li abbiamo nucleoatizzati con plasmidi di riprogrammazione episomiale per generare TSiPSC che possono essere utilizzate per la modellazione a valle della sindrome, in particolare i deficit neurologici associati (Figura 1a&b). Abbiamo usato vettori episomiali non ing…

Discussion

La generazione di modelli cellulari stabili di tessuto fetale citogeneticamente anormale è necessaria per perpetuare il fenotipo difettoso. La via iPSC è il metodo più efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua delle proprietà difettose²⁰.

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) mostrano proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione in cellule specializzate che ricordano gli embrioni di scissione precoce²¹. Quindi, …

Materials

0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	–	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays