Generering av induserte pluripotente stamceller fra Turners syndrom (45XO) Fosterceller for nedstrøms modellering av nevrologiske underskudd forbundet med syndromet

Summary

Denne protokollen beskriver genereringen av integrasjonsfrie iPSCer fra fostervevsfibroblaster gjennom levering av episomale plasmider ved kjerneofeksjon etterfulgt av beskrivelse av metoder som brukes til iPSC-karakterisering og nevronal differensiering.

Abstract

Kromosomale aneuploidier forårsaker alvorlige medfødte misdannelser, inkludert misdannelser i sentralnervesystemet og fosterdød. Prenatal genetisk screening er rent diagnostisk og belyser ikke sykdomsmekanismen. Selv om celler fra aneuploidfostre er verdifulle biologiske materialer som bærer kromosomal aneuploidy, er disse cellene kortvarige, noe som begrenser bruken av nedstrøms forskningseksperimenter. Generering av induserte pluripotente stamcellemodeller (iPSC) er en effektiv metode for celleforberedelse for evig bevaring av aneuploide egenskaper. De er selvfornyende og skiller seg ut i spesialiserte celler som minner om embryonal utvikling. Dermed fungerer iPSCer som gode verktøy for å studere tidlige utviklingshendelser. Turner syndrom (TS) er en sjelden tilstand forbundet med et helt eller delvis manglende X-kromosom. Syndromet er preget av infertilitet, kort statur, endokrine, metabolske, autoimmune og kardiovaskulære lidelser og nevrokognitive defekter. Følgende protokoll beskriver isolasjon og dyrking av fibroblaster fra TS (45XO) fostervev, generering av integrasjonsfrie TSiPSCer gjennom levering av episomale omprogrammeringsplasmider ved kjerneavsnitt etterfulgt av karakterisering. Omprogrammeringen av TSiPSCs ble først screenet av alkaliske fosfatasefarging i levende celler etterfulgt av omfattende undersøkelser for pluripotensbiomarkører. Utvalgte kolonier ble mekanisk dissekert, passert flere ganger og stabile selvfornyende celler ble brukt til videre eksperimenter. Cellene uttrykte pluripotenstranskripsjonsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2, celleoverflatemarkører SSEA 4 og TRA1-81 typisk for pluripotente stamceller. Den opprinnelige 45XO karyotypen ble beholdt etter omprogrammering. TSiPSCene var i stand til å danne embryoide legemer og differensiere i celler av endoderm, mesoderm og ectoderm som uttrykte avstamningsspesifikke biomarkører ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De eksogene episomale plasmidene gikk tapt spontant og ble ikke oppdaget etter passasje 15 i celler. Disse TSiPSCene er en verdifull cellulær ressurs for modellering av defekt molekylær og cellulær nevroutvikling som forårsaker nevrokognitive underskudd forbundet med Turners syndrom.

Introduction

Aneuploidies fører til fødselsskader/medfødte misdannelser og graviditetstap hos mennesker. ~50%-70% av prøver fra graviditet tap viser cytogenetiske abnormiteter. Aneuploid embryoer tapt tidlig i svangerskapet kan ikke lett oppnås for eksperimentell analyse øke behovet for å utvikle andre modeller som nært representerer menneskelig embryogenese. Induserte pluripotente stamceller (iPSCer) avledet fra celler diagnostisert med genetiske lidelser har blitt brukt til å modellere de representative genetiske uregelmessighetene og deres konsekvens på fosterutvikling^1,2,3,4. Disse iPSCene ligner epiblastomer i det utviklende embryoet og kan rekapitulere de tidlige hendelsene i embryodannelse. De tillater forståelse og karakterisering av utviklingsprogrammet for celleavstamninger og mønster i tidlige pattedyrembryoer. iPSCer avledet tidligere fra hudfibroblaster og amniocytter fra prenatale diagnostiske tester av aneuploidy syndromer som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) og delvis trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har gitt verdifull innsikt om mislykket utvikling⁴.

Turner syndrom (TS) er en sjelden tilstand preget av kvinnelig infertilitet, kort statur, endokrine og metabolske forstyrrelser, økt risiko for autoimmun sykdom og en predisponering for kardiovaskulær sykdom⁵. Selv om det er det eneste overlevende monosomisyndromet, er det også dødelig for det utviklende embryoet som forårsaker spontane aborter⁶. Overlevende individer med TS tilstede med grader av endring av X-kromosomalt materiale i sine celler. Karyotyper spenner fra fullstendig tap av ett X-kromosom (45,XO) til mosaikker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, tilstedeværelsen av ringkromosomer, tilstedeværelsen av Y-kromosomalt materiale, etc⁵.

Diagnose av syndromet gjøres vanligvis ved karyotyping blod av symptomatiske individer og chorionic villi sampling (CVS) for å oppdage tidlige aneuploidy syndromer. Siden aneuploidy syndromer står for ~ 30% av spontane aborter, er det rutinemessig å karyotype produktet av unnfangelse (POC) ved en spontan abort. Disse fostercellene, inkludert den chorioniske villi som har cytogenetisk abnormitet og iPSC avledet fra dem, gir en verdifull kilde til biologisk materiale for å studere aneuploidy syndromer^4,6. TS iPSCs har tidligere blitt etablert fra amniocytter via retroviral reprogrammering⁴, fibroblaster av chorionic villi (oppnådd gjennom prenatal diagnose) via retroviral reprogrammering⁶, fra blod mononukleære celler⁷ via Sendai virus reprogrammering og fra hudfibroblaster av TS individer via lentiviral reprogrammering⁴ . Siden hovedfokuset i laboratoriet vårt er å forstå utviklingssvikt, har vi generert TS iPSCer fra POC, spesielt den chorioniske villikomponenten i en spontan abort⁸. Alle cellene isolert fra dette fostervevet hadde en 45XO karyotype og ga iPSC med samme karyotype. Disse iPSCene er unike da de er de første som genereres fra et abortert foster og gir en verdifull ressurs for å studere aneuploidy relaterte graviditetsfeil. Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for generering av iPSCer fra denne unike cellekilden via episomal omprogrammering.

De tidlige metodene for iPSC-generasjonen brukte viral transduksjon og transposoner for å levere omprogrammeringsfaktorene. Metoder for å indusere celler til pluripotency har utviklet seg fra å bruke integrere retrovirale vektorer⁹, eksiserbare lentivirale vektorer^10,11 og transposonbaserte metoder¹² til ikke-integrerende adenovirale vektorer¹³ og Sendai virusbaserte vektorer¹⁴. Retroviral og lentiviral basert omprogrammering, selv om det er effektivt, innebærer integrasjon av omprogrammeringsfaktorene i vertskromosomene, noe som forårsaker innsettingsmutasjoner som har uforutsette effekter i iPSCene. Videre forhindrer viral-basert omprogrammering translasjonell anvendelse av iPSCer. RNA-baserte systemer¹⁵ og direkte proteinlevering¹⁶ er utforsket for å eliminere de potensielle risikoene forbundet med bruk av virus og DNA-transfeksjoner. Imidlertid har disse metodene vist seg ineffektive.

I 2011 rapporterte Okita et al. forbedret effektivitet av omprogrammering ved episomale plasmider forsterket med TP53-undertrykkelse via shRNA. De erstattet også cMYC med ikke-transformerende LMYC (litencellet lungekarsinom assosiert MYC) for å forbedre sikkerheten til hiPSCene. Disse episomale plasmidene uttrykker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC og shRNA for TP53^17,18. Disse vektorene opprettholdes ekstra kromosomalt og går tapt fra de omprogrammerte cellene ved kontinuerlig kultur, og gjør dermed linjene transgenefrie innen 10-15 passasjer. Kjerneofeksjon er en spesialisert form for elektroporasjon som leverer nukleinsyrer direkte inn i kjernen av vertsceller. Det er en effektiv metode for levering av omprogrammeringsplasmider til ulike celletyper. Episomale plasmider er kostnadseffektive og kompenserer de høye kostnadene ved kjerneofeksjon. Denne metoden er effektiv og reproduserbar under optimaliserte forhold som gir stabile iPSCer fra en rekke somatiske celler. I denne protokollen beskriver vi metoden for generering av iPSCer fra fibroblaster isolert fra fostervev ved kjerneofeksjon av episomale reprogrammeringsplasmider. Her er de detaljerte protokollene for fibroblastisolasjon fra føtal chorionic villi, plasmid rensing, kjerneofeksjon, plukking av kolonier fra omprogrammeringsplaten og etablering av stabile iPSCer.

Det er viktig å bekrefte tilstedeværelsen av pluripotensegenskaper i de nylig genererte iPSCene. Dette inkluderer demonstrasjon av pluripotensrelaterte faktorer (f.eks. alkalisk fosfataseuttrykk, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-kadherin; vanligvis vist med immunfluorescens eller genuttrykksanalyser), identifisering av de tre bakterielagene ved in vitro differensieringsanalyser for å validere deres differensieringspotensialer, karyotyping for å bestemme kromosomalt innhold, STR-skriving for å etablere identitet med foreldreceller, verifisere tap av eksogene gener, bekrefte tap av eksogene gener, og strengere in vivo-analyser som teratomadannelse og tetraploidkomplimentering. Her beskriver vi karakteriseringsprotokoller av karyotyping, levende celler alkalisk fosfatasefarging, påvisning av pluripotensrelaterte biomarkører ved immunfluorescens, in vitro differensieringsanalyser og metode for å demonstrere tap av eksogene gener¹⁹.

Protocol

FCV ble hentet fra Manipal Hospital, Bengaluru, under Etikkkomiteen for Manipal Hospitals godkjenning. MERK: Se tabell 1 for sammensetning av alle buffere og løsninger. 1. Isolering av fibroblaster fra føtal chorionic villi (FCV) Prøveinnsamling og vevsoppløsing i kollagenalisse Samle FCV under sterile forhold i fosfatbufret saltvann (PBS) og transport (ved romtemperatur) til cellekulturanle…

Representative Results

Generering av integrasjonsfrie iPSCer fra et spontant abortert foster med 45XO karyotypeVi isolerte fibroblaster fra FCV med et Turner syndrom (TS) spesifikk 45XO karyotype og nukleofekterte dem med episomale reprogrammeringsplasmider for å generere TSiPSCer som kan brukes til nedstrøms modellering av syndromet, spesielt de tilhørende nevrologiske underskuddene (Figur 1a&b). Vi brukte ikke-episomale vektorer og kjerneaveksjon for transfeksjonsforsøke…

Discussion

Generering av stabile cellulære modeller av cytogenetisk unormalt fostervev er nødvendig for å opprettholde defekt fenotype. IPSC-ruten er den mest effektive metoden for celleforberedelse for evig bevaring av defekte egenskaper²⁰.

Pluripotente stamceller (PSC) viser egenskaper til selvfornyelse og differensiering i spesialiserte celler som minner om tidlige spaltingsembryoer²¹. Derfor kan PSCer tjene som gode modeller for å studere tidlige mo…

Materials

0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	–	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays