Vand-i-olie dråbe assays er nyttige for analytisk kemi, enzym evolution, og enkelt celle analyse, men kræver typisk mikrofluidics at danne dråber. Her beskriver vi partikelskabelon emulsificering, en mikrofluidisk-fri tilgang til at udføre dråbe assays.
Reaktioner udført i monodispersed dråber giver forbedret nøjagtighed og følsomhed i forhold til tilsvarende dem, der udføres i løs vægt. Kravet om mikrofluidics om at danne kontrollerede dråber pålægger imidlertid en barriere for ikke-eksperter, hvilket begrænser deres anvendelse. Her beskriver vi partikelskabelon emulsivering, en tilgang til at generere monodispersedråber uden mikrofluidics. Ved hjælp af templating hydrogel kugler, indkapsler vi prøver i monodispersed dråber ved simpel vortexing. Vi demonstrerer tilgangen ved at bruge den til at udføre mikrofluidisk-fri digital PCR.
Dråbe mikrofluidics udnytter opdeling i picoliter dråber til at øge følsomheden og nøjagtigheden af assays i forhold til bulk reaktioner, og har mange anvendelser i kemisk screening, protein engineering, og næste generation sekventering1,2,3. For eksempel giver digital dråbe polymerase kædereaktion (ddPCR) øget nøjagtighed sammenlignet med bulk kvantitativ polymerase kædereaktion (qPCR), med applikationer til genetisk variation i kræft, påvisning af sygdom forårsager mutationer, og prænatal diagnostik4,5,6. En udfordring ved dråbemikrofluidics er imidlertid kravet om mikrofluidiske anordninger til at opdele prøver; mens mikrofluidics giver fremragende kontrol over dråbe egenskaber, de kræver specialiseret ekspertise til at bygge og drive7,8. Derfor er dråbebaserede metoder i vid udstrækning begrænset til ekspertlaboratorier eller i sjældne tilfælde applikationer, hvor et kommercielt instrument er tilgængeligt9,10. For at udvide brugen af dråbe assays, kravet om specialiseret mikrofluidisk instrumentering er en forhindring, der skal overvindes.
I denne artikel beskriver vi partikelskabelon emulsification (PTE), en mikrofluidisk-fri metode til udførelse af reaktioner i monodispersed dråber. I PTE opsluger templaterende partikler prøven til dråber i bæreolie ved simpel hvirvlen (figur 1). Som systemet blander, den vandige del fragmenter i dråber af reducerende størrelse, indtil dråberne indeholder enkelte partikler, hvorefter yderligere fragmentering er ikke muligt, fordi det kræver at bryde partiklerne. Den opslugte prøve omgiver partiklerne som en skal i dråberne og indkapsler derved eventuelle spredte celler, reagenser eller funktionelle moietier (figur 1D). Pte kræver således intet udstyr eller ekspertise til at udføre dråbereaktioner ud over en almindelig vortexer. Derudover tager dråbegenerering sekunder sammenlignet med minutter eller timer med mikrofluidics, og den producerede mængde er proportional med beholdervolumen, ikke enhedens driftstid, hvilket gør den yderst skalerbar. Disse fordele gør PTE ideel til at gennemføre dråbe assays i en række forskellige omstændigheder, hvor mikrofluidics er upraktisk. Her demonstrerer vi PTE og bruger den til at udføre ddPCR.
Figur 1. Oversigt over partikelskabelon emulsiveringsproces. (A) Templating partikler blandes med reagenser. (B) Overskydende reagenser fjernes efter centrifugering. (C) Tilsætning af skabelonmolekyler sker før tilsætning af olie. (D) Vortexing producerer dråber, der indeholder et enkelt skabelonmolekyle. (E) Efterfølgende termocykling og billeddannelse giver mulighed for digital dråbeanalyse af målskabelonen. Klik her for at se en større version af dette tal.
PTE bruger partikler til at indkapsle prøver i monodispersed dråber ved hvirvlende. Ud over sin enkelhed og tilgængelighed giver PTE flere yderligere fordele, herunder at tillade store mængder dråber at blive genereret øjeblikkeligt. Desuden kan processen udføres i et isoleret rør, hvilket fjerner behovet for at overføre prøver til mikrofluidiske enheder, strømline den samlede arbejdsgang og begrænse mulighederne for prøveforurening eller tab. De templaterende partikler giver også et middel til at konstruere indholdet af de resulterende dråbereaktioner. For eksempel kan partikelstørrelse, kemi og vådhed konstrueres til målrettet biomolekyle eller cellefangst, mens funktionelle moietier som enzymer, actives eller nukleinsyrer kan vises på partikel for at lette reaktioner, såsom for enkeltcellesekvensering eller funktionel karakterisering. Selv om tilgangen er fleksibel, er der ikke desto mindre vigtige begrænsninger for dens anvendelse. For eksempel er det i øjeblikket ikke muligt at udføre dråbetilsætninger, som ofte udføres med mikrofluidics, hvilket kræver, at alle reaktionskomponenter introduceres før indkapsling; Dette kræver, at reagenser er kompatible og stabile, indtil dråberne kan genereres, og i tilfælde af besværlige kombinationer kan man ofte løses ved hurtigt at blande og emulgere prøven på is. Alternativt kan reaktive komponenter, der kan udløses eksternt med lys eller varme, bruges13. PTE giver således en fleksibel og skalerbar metode til udførelse af dråbeanalyser, der er tilgængelige for ikke-eksperter. Dette, kombineret med sin medfødte enkelhed og fleksibilitet, gør PTE ideel til udførelse og udvikling af mange dråbe applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde med at udvikle denne protokol blev støttet af National Institutes of Health (R01-EB019453-02), kontoret for direktøren for National Intelligence, Intelligence Advanced Research Projects Activity gennem Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency gennem Texas A &M University (W911NF1920013) og Centers for Disease Control and Prevention gennem Johns Hopkins University Applied Applied Fysiklaboratoriet (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). De synspunkter og konklusioner, der er indeholdt heri er forfatternes og bør ikke fortolkes som nødvendigvis repræsenterer de officielle politikker, enten udtrykt eller underforstået, af ovennævnte organisationer eller den amerikanske regering. Den amerikanske regering er bemyndiget til at reproducere og distribuere genoptryk til statslige formål uanset enhver copyright anmærkning deri.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |